广藿香总黄酮提取工艺及抑菌活性研究

韩芸，梁伟玲，徐迎涛，吴君，李德芳，*

（1.滨州医学院，山东烟台264003；2.山东中医药高等专科学校，山东烟台264199）

广藿香总黄酮提取工艺及抑菌活性研究

韩芸1，梁伟玲2，徐迎涛2，吴君2，李德芳1，*

（1.滨州医学院，山东烟台264003；2.山东中医药高等专科学校，山东烟台264199）

优化广藿香总黄酮提取工艺并评价其抑菌活性。在单因素试验的基础上选择提取时间、温度、液料比采用三因素三水平的RSM试验设计，优化其工艺参数；通过对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、鼠伤寒沙门氏菌及枯草芽孢杆菌抑制作用评价广藿香总黄酮抑菌作用。通过RMS模型预测，最优提取条件为：乙醇浓度85%，提取温度86.5℃，提取时间90min，液料比51.2∶1（mL/g），提取1次，在此条件下广藿香总黄酮提取率理论值为0.889mg/g。实际值为（0.878± 0.027）mg/g（n=3）；广藿香总黄酮浓缩液对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌均具有明显的抑制作用，与5%苯甲酸钠溶液抑菌活性相当。

广藿香；总黄酮；提取工艺；抑菌

广藿香为唇形科植物广藿香Pogostemon cablin（Blanco）Benth.的干燥地上部分，具有芳香化浊、和中止呕、发表解暑等功效[1]；广泛分布于中国、印度尼西亚、马来西亚及巴西。广藿香主要有效成分为挥发性成分，目前有关广藿香挥发油成分方面的文献报道较多，不同部位挥发油含量与种类均不同[2]，主要包括黄酮、烯烃、萜烯类及萜醇类化合物[3]，其中以广藿香醇（百秋李醇）、广藿香烯、广藿香酮为其特征成分。而历版《中国药典》均以广藿香醇为广藿香药材的质量控制指标，对广藿香中黄酮类成分研究尚不够重视。此外，目前广藿香中总黄酮的提取工艺优化还无报导。因此本文以广藿香中总黄酮为研究对象，采用响应面法（RSM）优化其提取工艺并研究其抑菌活性。

1 材料与仪器

1.1 试验材料

广藿香药材：广东致信药业（批号：20141012）；芦丁：中国食品药品检定研究院（批号：100080-201409）；

聚酰胺：上海阿拉丁生化科技股份有限公司（80目～100目，使用前用体积分数90%乙醇预处理）；NaNO2、Al（NO3）3、NaOH及乙醇等均为分析纯（AR）。

金黄色葡萄球菌（Staphylococcusaureus）、大肠杆菌（Escherichia coli）、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis）：购自于广东省微生物研究所。

1.2 试验仪器

层析柱（2.6 cm×30 cm）：江阴市新辉层析设备有限公司；UV-360紫外分光光度计：日本岛津公司；TDL-5低速台式大容量离心机：上海安亭；FA2004N万分之一分析天平：上海菁科仪器有限公司；XSE-105十万分之一分析天平：梅特勒-托利多公司；YB-300A多功能粉碎机：运邦中药粉碎机厂。

2 方法及结果

2.1 广藿香总黄酮含量测定

2.1.1 标准曲线的绘制[4]

精密称取芦丁对照品10.28mg，置于20mL容量瓶中，以85%乙醇定容至刻度，即得0.514mg/mL对照品溶液。分别吸取0.2、0.4、0.8、1.2、2.0mL于10mL容量瓶中，以85%乙醇定容至刻度。取各浓度对照品溶液5mL于具塞试管中，分别加入0.6mL质量分数5% NaNO2溶液，摇匀后静置5min，再分别加入0.6mL质量分数10%Al（NO3）3溶液，摇匀，静置5min，再加入5mL 4%NaOH溶液，摇匀、静置15min。以85%乙醇为空白校零，于509 nm处测量各浓度对照品的吸光度值（Abs），以芦丁对照品溶液浓度（X，μg/mL）为横坐标、Abs（Y）为纵坐标绘制标准曲线，标准曲线方程为：

2.1.2 广藿香供试品溶液的制备

精密称取广藿香粉末（过40目筛）2.0 g，加入100mL 85%乙醇，80℃下回流提取90min，趁热过滤提取液，将提取液用旋转蒸发仪蒸干溶剂，再用85%乙醇冲洗、溶解圆底烧瓶上残渣，转移至20mL容量瓶中并用85%乙醇定容，即得广藿香供试品溶液。

2.1.3 精密度试验考察

精密称定广藿香粉末（过40目筛）2.0 g，按“2.1.2”中方法制备供广藿香试品溶液、测定Abs，试验平行6次，结果Abs的RSD值为0.93%，表明方法精密度良好。

2.1.4 重复性试验考察

精密称定6份广藿香粉末（过40目筛）2.0 g，按“2.1.2”中方法制备供广藿香试品溶液、测定Abs，试验平均3次，测定广藿香总黄酮含量为0.821mg/g，RSD值为0.88%。表明试验方法重复性良好。

2.1.5 稳定性试验考察

精密称定广藿香粉末（过40目筛）2.0 g，按“2.1.2”中方法制备供广藿香试品溶液，分别于0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 h测定Abs，结果Abs的RSD值为1.04%，表明试验稳定性良好。

2.1.6 加样回收率考察

精密称定6份广藿香粉末（过40目筛）1.0 g，加入0.514mg/mL对照品溶液1.6mL，按“2.1.2”中方法制备供广藿香试品溶液，测定吸光度值，结果加样回收率为99.3%，RSD值为1.16%，表明加样回收率满足试验需求。

2.2 单因素试验

2.2.1 乙醇浓度对提取率的影响

分别以65%、75%、85%、90%及95%乙醇为提取溶剂，考察不同浓度的乙醇溶剂对总黄酮提取率的影响，其余条件同“2.1.2”项，测定Abs，计算广藿香总黄酮提取率，结果见图1。

图1 乙醇浓度对提取率的影响Fig.1 Effectof ethanolconcentration on extraction rate

结果表明乙醇浓度在85%左右时，总黄酮提取率最高，超过乙醇浓度85%后其提取率反而下降，因此选择85%乙醇为提取溶剂。

2.2.2 提取时间对提取率的影响

精密称取5份广藿香粉末（过40目筛）2.0 g，加入100mL 85%乙醇，分别回流提取50、60、70、80、90、100min，其余同“2.1.2”项下内容，计算广藿香总黄酮提取率，结果见图2。

图2 提取时间对提取率的影响Fig.2 Effectof extraction tim eon extraction rate

结果表明，随着提取时间的增加，总黄酮提取率

也在增加，但超过80min，提取率增加不明显，因此选择80min为最佳提取时间。

2.2.3 提取温度对提取率的影响

精密称取5份广藿香粉末（过40目筛）2.0 g，加入100mL 85%乙醇，分别于55、65、75、85、95℃下回流提取80min，其余同“2.1.2”项下内容，计算广藿香总黄酮提取率，结果见图3。

图3 提取温度对提取率的影响Fig.3 Effectofextraction tem peratureon extraction rate

结果表明，总黄酮提取率随着提取时间的增加而增加，但超过85℃后，提取率不再增加，因此选择85℃为最佳提取温度。

2.2.4 液料比对提取率的影响

精密称取5份广藿香粉末（过40目筛）2.0 g，分别加入70、80、90、100、110mL 85%乙醇，85℃下回流提取80min，其余同“2.1.2”项下内容，计算广藿香总黄酮提取率，结果见图4。

图4 液料比对提取率的影响Fig.4 Effectof liquid tomaterial ratio on extraction rate

结果表明，总黄酮提取率随着液料比的增加而增加，最优液料比为50∶1（mL/g）左右。

2.2.5 提取次数对提取率的影响

精密称取3份广藿香粉末（过40目筛）2.0 g，加入100mL 85%乙醇，85℃下回流提取80min，分别提取1、2、3次，其余同“2.1.2”项下内容，计算总黄酮提取率，结果见图5。

图5 提取次数对提取率的影响Fig.5 Effectof extraction timeson extraction rate

结果表明提取次数对提取率无明显影响，可能因为液料比较大，提取比较完全。从节约材料及能源角度出发，选择提取1次。

2.3 RSM法优化提取工艺

通过单因素试验优选出乙醇浓度为85%、提取时间80min、提取温度85℃、液料比50∶1（mL/g），提取次数1次；将乙醇浓度固定为85%、提取次数为1次，分别设定80min、85℃及50∶1（mL/g）为提取时间（X1）、提取温度（X2）及液料比（X3）的中心点（0值），上下浮动，以总黄酮提取率为响应值（Y），设计3因素3水平的Box-Behken试验，试验设计及结果见表1～表2。

表1 Box-Behken试验设计因素及水平Table1 Factorsand levelsof Box-Behken design

表2 总黄酮提取率的响应面试验结果Table2 Resultsof total flavonoidsextraction rateby response surfacem ethod

对表2数据采用Design Expert8.0.5软件进行处理和分析，获得总黄酮提取率（Y）对提取时间（X1）、提取温度（X2）及液料比（X3）的二次多元回归方程：

该回归方程的方差分析结果见表3。

表3 回归系数及显著性检验结果Table3 Resu ltsof regression coefficientand significance test

表3显示模型的P＜0.01，表明该回归方差模型极其显著，说明试验方法可靠。回归系数R2=0.995＞0.9，表明该模型相关度好。其中X1、X2、X3、X1X2、X12及X32方差分析的P值均小于0.01，表明差异极其显著。响应面3D模型及等高线图见图6～图8。

图6 提取时间与提取温度对提取率影响的响应面和等高线图Fig.6 Response surfaceand contourmap ofextraction timeand extraction tem peratureaffecton theextraction rate

图7 提取时间与液料比对提取率影响的响应面和等高线图Fig.7 Responsesurfaceand contourmap ofextraction timeand liquid tom aterial ratio affecton theextraction rate

图8 液料比与提取温度对提取率影响的响应面和等高线图Fig.8 Responsesurfaceand contourmap ofextraction tem peratureand liquid tomaterial ratio affecton theextraction rate

根据试验所得模型，预测最优工艺条件：乙醇浓度为85%，提取温度86.5℃，提取时间90min，液料比51.2∶1（mL/g），提取1次，在此条件下广藿香总黄酮提取率理论上可达到0.889mg/g。经3次平行试验，提取率实际值为（0.878±0.027）mg/g（n=3），与理论值较为吻合，因此，采用RSM法优化得到的提取条件参数可靠。

2.4 广藿香总黄酮抑菌活性

2.4.1 聚酰胺纯化总黄酮[4]

按2.3项下优化条件提取总黄酮，提取液浓缩至适量，上聚酰胺层析柱，首先采用去离子水洗脱，至洗脱液无色后再用相当于5倍柱体积的20%（体积分数）乙醇冲洗，弃洗脱液，再用50倍柱体70%（体积分数）乙醇洗脱，收集该段洗脱液，浓缩至1 g/mL左右，即得纯化的广藿香总黄酮浓缩液。

2.4.2 菌悬液的制备

将菌种接种到相应的斜面培养基，细菌37℃培养24 h，连续培养3次。以无菌生理盐水配制成菌体浓度为106cfu/mL～107cfu/mL的菌悬液，备用。

2.4.3 抑菌作用的测定[5]

培养皿（直径15 cm），每培养皿加入培养基40mL，待凝固后，移取各细菌悬液0.6mL加入各平板上，涂布均匀，每皿平稳、等距放置5个灭菌牛津杯，于其中滴加广藿香总黄酮浓缩液，以5%苯甲酸钠及灭菌生理盐水作为阳性及阴性对照，每菌平行操作3次。移去牛津杯，量取各抑菌圈直径，结果见表4。

表4 广藿香总黄酮抑菌圈直径Table4 Inhibitory circle diameter of total flavonoids from Pogostemon cablin mm

表4显示，广藿香总黄酮浓缩液对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌均具有明显的抑制作用，抑菌顺序为金黄色葡萄球菌＞枯草芽孢杆菌＞鼠伤寒沙门氏菌＞大肠杆菌。各组与5%苯甲酸钠溶液对比，均无显著性差异。

3 小结与讨论

目前工艺参数优化的设计主要有正交试验设计、均匀试验设计、响应面法试验设计等；响应面法通过多元二次回归方程来拟合各试验参数与响应值之间的函数关系，对回归方程进行二阶偏导数求导计算得到最优工艺参数，相比于其他优化方法，可以客观表达出工艺参数之间的交互作用，并预测最优参数组合[6]。本实验通过RSM优化后参数提取总黄酮，其提取率明显高于其他参数下的提取率。

黄酮类有效物质的提取方法有微波辅助提取、超声波辅助提取及热回流提取等。微波、超声波辅助提取虽然快捷、高效的优势，但易导致黄酮类成分结构破坏、分解，不易控制提取时间，反而降低总黄酮提取率[7-8]。因此本文采用传统的热回流提取方法提取总黄酮。

RSM用于广藿香总黄酮提取条件优化方法可靠；此外，广藿香总黄酮对鼠伤寒沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠杆菌具有良好的抑菌活性。

[1]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典(第一部)[S].北京:中国医药科技出版社,2014:45

[2] 陈秀华,刘强,陈兴兴,等.广藿香不同部位挥发油成分的比较研究[J].辽宁中医药大学学报,2008,10(4):127-128

[3]吴友根,郭巧生,梁振益,等.海南广藿香叶和茎挥发油化学成分的气相色谱-质谱联用分析[J].时珍国医国药,2012,23(3):527-530

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[6] 李世杰,张丹雁,严娅娟,等.响应面法优化阳春砂多糖的超声辅助提取工艺[J].中国实验方剂学杂志,2013,19(22):47-51

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Study on Extraction and Antibacterial Activities of Total Flavonoids from Pogostemon cablin（Blanco）Benth.

HANYun1，LIANGWei-ling2，XU Ying-tao2，WU Jun2，LIDe-fang1，*
（1.Binzhou MedicalUniversity，Yantai264003，Shandong，China；2.Shandong Collegeof Traditional ChineseMedicine，Yantai264199，Shandong，China）

To optimize the extraction process of total flavonoids from Pogostemon cablin and evaluate its antibacterialactivity，3 factorsand 3 levelsofRSM was designed to optimize the extraction time，temperature and ratioof liquid tomaterial，and the processparameterswereoptimized based on the single-factorexperiment.Inhibition effectof total flavonoids of Pogostemon cablin was evaluated by the effect on Staphylococcus aureus，Escherichia coli，Salmonella typhimurium and Bacillus subtilis.Predicted by themodel of RSM，the best extraction conditionswere ethanol concentration 85%，extraction temperature 86.5℃，extraction time 90min，ratio of liquid tomaterial51.2∶1（mL/g）.Under these conditions，the theoretical valuesofextraction ratewas 0.889mg/g and the actualvaluewas（0.878±0.027）mg/g（n=3）.Total flavonoids from Pogostemon cablin had obvious inhibitory effecton Salmonella typhimurium，Staphylococcusaureus，Bacillus subtilis and Escherichia coli，and theantibacterialactivitywasequivalent to5%ofsodium benzoatesolution.

Pogostemon cablin（Blanco）Benth.；total flavonoids；extraction process；antibacterialactivity

10.3969/j.issn.1005-6521.2016.23.016

2016-03-24

山东省高等学校优势学科人才团队培育计划（The Dominant Disciplines'Talent Team Development Scheme of Higher Education of Shandong Province）

韩芸（1982—），女（汉），讲师，博士生，研究方向：中药复发药理研究。

*通信作者