竹燕窝的分子鉴定及金属元素的含量分析

□ 潘洁莉　高丽娜　盛振华　李美芽　浙江中医药大学

竹燕窝的分子鉴定及金属元素的含量分析

□ 潘洁莉高丽娜盛振华李美芽浙江中医药大学

竹燕窝，又名竹菌，有抗菌消炎、润肺滋阴、美容养血等功效，是珍稀的真菌类微生物。主产自四川和云南，在浙江少见。因其形与味如同燕窝，口感润滑清香，营养价值甚高，被誉为植物燕窝，曾历次受央视等媒体的关注。研究表明，竹燕窝多糖具有一定的抗氧化活性，其醇提物对人食道癌、乳腺癌、白血病和肝癌均具有较好的预防功能。

作为一种绝美食品，食用安全性十分重要。食品中的金属元素含量是当前人们关心的重点，重金属会通过食物链进入人体会带来潜在的健康危机。因此，对食品中金属元素含量分析十分必要。目前，竹燕窝中金属元素含量的研究还未见报道，本研究对浙江杭州的竹燕窝进行分子鉴定后，采用ICP-AES测定其中9种金属元素的含量，了解竹燕窝的生长地域性和环境特殊性，为竹燕窝作为食品保健品提供理论参考。

材料与方法

材料

电感耦合等离子体发射光谱仪，Therm o Scientific公司；Coolsafe冷冻干燥仪，丹麦Labogene公司；PCR仪，德国Eppendorf公司。

砷、钙、镉、铁、铜、汞、锰、铅和锌9种重金属单元素，均购自环保部标准样品研究所；硝酸，购自国药集团化学试剂有限公司；氩气（含量大于99.99%），购自上海五钢气体有限责任公司；竹燕窝，采自浙江省杭州市。

方法

1 竹燕窝显微观察

挑取少量竹燕窝子实体，压片后置于光学显微镜下观察子实体和孢子形态。

2 基因组DN A提取

采用CTAB法提取子实体基因组DN A，纯度合格的DN A作为PCR扩增的模板。

3 ITS序列的扩增和分析

用真菌rRN A基因的ITS区扩增通用引物18SF（5’-TCCG TAG G TG AACCTG CG G-3’）和28SR（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）进行PCR，扩增产物送上海生工生物工程有限公司测序。测得的序列采用Blast比对分析，获得指标靠前的相似序列，通过M EGA软件以最大似然法构建N J系统发育树。树形图上的百分数表示比较菌株之间的相似度。

4 金属元素含量分析

（1）样品处理。取新鲜采取的竹燕窝，超纯水清净，-80 ℃冷冻过夜，于冷冻干燥仪中冻成干粉。准确称取三份样品各约0.5 g（精确到0.0001 g）置于微波消解罐中，加入10 m L硝酸静置过夜，然后装好外罐在微波消解仪中进行消解，冷却后转移置50 m L容量瓶中，加超纯水稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液备用。另取10 m L消化液，同法制作空白溶液。

（2）标准曲线绘制。分别吸取一定量的各元素标准品，用30%硝酸溶液配置4种不同浓度的混合溶液。依次在相应波长下测定各个不同质量浓度的混合标准溶液的吸光度，每一质量浓度测定3次，以吸光度Y为纵坐标，相应元素标准溶液质量浓度X（μ g/m L）为横坐标，绘制标准曲线并确定其相关系数及线性范围。

（3）样品微量元素含量测定。设定仪器入射功率：1150 W；辅助流速：0.5 L/m in；雾化器泵流量：50 r/m in；分析泵速：50 r/m in；最大积分时间：30 s；冲洗3次，每次30 s。根据各元素含量的不同，选择灵敏度较高，其他元素干扰最小的谱线作为分析线。按上述设定的仪器操作条件，测定供试品溶液的吸光度，由各元素的回归方程，计算相应的浓度，扣除试剂的空白值，得出样品中各元素的含量。

结果与讨论

子实体形态特征

从图1中可看出，竹燕窝子实体丛生，呈淡黄色珊瑚状（图1-A）。分支很多，分支明显，尖端黑色部分为分生孢子器（图1-B/C）。将分生孢子器进行压片后于光学显微镜下观察，可见孢子为椭圆形，中间有1～2个球状物（图1-D）。

图1　竹燕窝子实体以及孢子形态

分子鉴定

将测得的ITS序列用Blast比对分析，发现其序列与Scorias spongiosa（HM 480490.1）最为接近，相似性可达99%，可推测该竹燕窝的形成菌株为Scorias spongiosa，与贺庆生分离的竹燕窝菌株为同一种菌株。在N CBI上下载与该菌株的ITS序列接近的一些菌株的序列，采用M EGA软件以最大似然法构建了N J进化树，如图2所示。可看出，浙江产的竹燕窝与HM 480490.1进化关系最为接近，可达87%。

图2　竹燕窝的系统发育树

国家食用菌标准参考

参考《食品安全国家标准》（GB 2762-2012）食用菌类中的限量标准，可发现浙江竹燕窝中的Hg、Pb、Cd、As含量均较低，符合食品安全标准。Cu、M n、Zn、Fe、Ca含量较高，Fe、Zn、Cu、M n是人体必需的微量元素，钙是人体必需的常量元素，这些都是对人体有益的元素。

结论

元素含量检测

从表1可以看出，各元素的回归方程线性关系很好，相关系数均可达到0.999以上，可用于后续样品中元素含量的测定。

将竹燕窝样品溶液按仪器工作条件进行检测。测得数据代入回归方程后扣除空白值，得到样品中各元素的浓度，根据所称量的重量，换算成质量比，结果见表2。

元素平均值±误差限H g 0 . 0 1 3 ± 0 . 0 0 1 P b 0 . 3 3 0 ± 0 . 0 3 2 C d 0 . 0 3 0 ± 0 . 0 0 4 A s 0 . 0 0 0 ± 0 . 0 0 0 C u 7 . 8 1 6 ± 0 . 1 0 0 M n 1 0 . 8 6 0 ± 0 . 1 0 1 Z n 2 0 . 0 1 2 ± 0 . 2 5 5 C a 7 4 1 3 . 7 1 6 ± 2 6 . 2 8 F e 4 7 . 1 4 1 ± 0 . 3 3 7

本研究对浙江竹燕窝进行分子鉴定，并采用微波消解ICP-AES法测定其中的9种金属元素的含量。所测定的竹燕窝样品中的Hg、Pb、Cd、As的含量均符合我国食品安全国家标准GB 2762-2012。食品中污染物限量标准并未对Fe、Zn、Cu、M n的含量进行限定，因此无法判断竹燕窝样品中这四种元素的含量是否超标。但Fe、Zn、Cu、M n、Ca都是人体所必需的元素，在人体的生命活动过程中起着重要的作用。这些元素含量与种植环境中的土壤和水源有一定的关系，从研究结果来看，浙江竹燕窝可作为安全食品，可补充人体所必需的Ca、Fe等元素。本研究为了解竹燕窝的营养价值提供了理论基础。

浙江中医药大学科研基金（编号：2014ZR12），浙江中医药大学基础医学院科研基金（编号：JC201308）。

李美芽。

潘洁莉（1986-），女，硕士，助理实验师。研究方向：生物化学与分子生物学。