海湾扇贝维甲酸受体(RXR) cDNA克隆与表达分析

张 瑞, 阙华勇, 丛日浩, 李 莉, 张国范



海湾扇贝维甲酸受体(RXR) cDNA克隆与表达分析

张 瑞1, 2, 阙华勇1, 丛日浩1, 李 莉1, 张国范1

(1. 中国科学院海洋研究所, 山东青岛 266071; 2. 中国科学院大学, 北京 100049)

维黄酸受体(RXR)是核受体超家族的重要成员, 已有研究表明其在脊椎动物中广泛参与调控生长发育、新陈代谢等多种重要的生理过程。本研究采用 RACE 技术克隆获得海湾扇贝() RXR (AiRXR) cDNA序列, 采用荧光定量RT-PCR 技术分析该基因在性腺发育不同时期的不同组织中的表达特点。结果表明, AiRXR的cDNA序列开放阅读框为1338bp, 含有两个亚型: AiRXRα和AiRXRβ, 两个亚型之间在T-box中相差4个氨基酸。该蛋白序列与人 () 和栉孔扇贝 () 等的RXR相似性很高。AiRXR进化树分析显示, AiRXR与软体动物RXR聚为一支。AiRXR基因具有广泛的组织表达特点, 在检测的组织中(外套膜、鳃、性腺、闭壳肌)均有表达, 推测AiRXR以信号分子的形式参与多种组织细胞的生命过程; 在海湾扇贝性腺发育过程中AiRXR基因在性腺发育的各时期均有表达且增殖期表达量最高, 说明AiRXR基因可能参与调节性腺发育和分化的过程。

海湾扇贝(); RXR基因; 组织表达; 性腺发育

核受体超家族是一大类组成型的转录因子, 能够调控多种代谢途径如胚胎发育、内环境和生理的稳态[1]。维甲酸X受体 (RXR) 作为核受体超家族中的一员, 含有5个典型的核受体结构域: A/B、C、D、E和F。A/B结构域中含有活性的配体非依赖性的转录激活域 (AF-1), 能够增强E结构域中AF-2的作用, 从而上调靶基因的表达。C结构域中含有高度保守的DNA结合结构域, 该结构域中含有两个锌指结构, 能够介导核受体与位于靶基因启动子区域的特异顺向重复序列(也称反应元件)结合。D结构域是铰链结构域, 含有一个相对保守的配体结合结构域 (LBD), 可以与配体结合, 改变蛋白结构进而诱导基因表达, E区含一个配体依赖性的转录激活域 (AF-2), 它能传递配体结合信号, 控制配体依赖的转录和激活; F结构域序列保守性很低, 具有较高的可变性[2-3]。在脊椎动物中, RXR分为三个亚型: α、β和γ, RXR作为转录因子与其他核受体成员如蜕皮激素受体(EcR)、视黄酸受体 (RAR)、过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR) 形成二聚体结合靶基因参与胚胎发育、细胞增殖与分化、新陈代谢等多种重要的生理过程[4-6]。在无脊椎动物如海绵动物[7]、昆虫[8]、甲壳动物[9]等类群中也克隆获得RXR的同源基因序列。

海湾扇贝 (自然分布于美国的东海岸和墨西哥湾沿岸, 于1982年首次成功引入我国, 实现了苗种全人工培育, 带动海湾扇贝成为我国主要海水养殖贝类之一[10]。性腺发育分为五个时期: 分化期、增殖期、成熟期、排放期和休止期[11-12]。亲贝性腺发育的成熟度和同步性直接影响着苗种生产成败, 但迄今对贝类性腺发育的分子调控机制知之甚少。本研究采用 RACE 技术克隆获得海湾扇贝RXR cDNA序列并分析其结构, 采用荧光定量RT-PCR 技术分析该基因在性腺发育不同时期的不同组织中的表达特点, 旨在探究RXR基因在海湾扇贝发育过程中的调控作用, 为进一步开展双壳类RXR的功能研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 海湾扇贝样品的获取

海湾扇贝()取自青岛市古镇口湾, 在性腺发育的5个时期: 分化期、生长期、成熟期、排放期和休止期分别采集其鳃、性腺、外套膜、闭壳肌的组织样品, 取样后的组织置于–80℃冰箱中待用。

1.2 海湾扇贝RXR基因的克隆

采用Trizol 法提取海湾扇贝总RNA, 用1%琼脂糖凝胶电泳检测RNA的完整性。用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific) 检测提取的RNA 浓度。使用PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa, Japan) 合成RACE cDNA 第一条链, 以此为模板进行PCR扩增。利用海湾扇贝转录组测序的数据获得RXR基因序列片段, 根据获得的基因片段设计引物: AiRXR-F和AiRXR-R, 凝胶电泳检测条带的大小, PCR反应体系为25 μL, 其中cDNA模板2 μL、EX-taq酶 (TaKaRa, Japan) 12.5 μL、灭菌水10 μL、引物各0.5 μL, PCR反应条件: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共35个循环, 72℃延伸10 min。对该基因片段进行验证后, 设计RACE引物。采用巢式PCR扩增得到海湾扇贝 RXR cDNA的全长, RXR基因的全长所用引物见表1。PCR反应体系25 μL, 其中cDNA模板2 μL、LA-taq酶 (TaKaRa, Japan) 12.5 μL、灭菌水10 μL、引物各0.5 μL, PCR反应条件: 94℃ 5 min; 94℃ 30 s, 56℃ 30 s, 72℃ 2 min, 共35个循环, 72℃延伸10 min。扩增并纯化后连接到pEASY-T1 载体(北京全式金生物技术公司)并转化到大肠杆菌Trans-T1 感受态细胞 (北京全式金生物技术公司)中, 涂平板, 37℃培养过夜, 挑取抗氨苄青霉素的阳性克隆, 经菌液PCR检测后, 交由北京六合华大股份有限公司进行测序。

1.3 RXR基因序列分析及系统进化分析

运用ORF finder (http: //www.ncbi.nlm.nih.gov/ projects/gorf/) 预测克隆基因的开放阅读框 (ORF), 在NCBI Genbank BLAST (http: //www.ncbi.nlm.nih. gov/genbank/) 寻找与海湾扇贝RXR的同源序列, 通过CLUS-TALW (http: //www.ebi.ac.uk/Tools/msa/ clustalo/) 进行多序列同源比对, 并用BioEdit软件分析。根据在线BLASTp(http: //blast.ncbi.nlm.nih. gov/Blast)对蛋白结构进行预测, 利用MEGA软件 (http: //www.megasoftware.net)中的最大似然法对预测RXR的DBD和LBD的结构域构建进化树。

1.4 海湾扇贝各组织RXR基因的表达

利用ABI 7500 Fast 荧光定量PCR仪, 分析海湾扇贝RXR (RXR, AiRXR) 在海湾扇贝性腺发育5个时期不同组织中的定量表达, 每个样本做3 个平行检测。已有的研究表明, RXR的异构体在组织的表达没有明显的差异[13], 因此在海湾扇贝RXR cDNA的保守区设计荧光定量PCR的引物: AiRXR-DOU-F和AiRXR-DOU-R(表1)。荧光定量RT-PCR 反应条件: 94℃ 30s, 1个循环; 94℃ 5s, 60℃ 30s, 40个循环。通过ABI 7500 Fast SDS software V2.0 软件输出数据, 采用2–DDCt法对基因的相对表达量进行分析, 18S rRNA 作为内参基因。使用EXCEL软件进行统计分析(0.05)。

表1 引物序列

2 实验结果与分析

2.1 海湾扇贝RXR基因的cDNA 克隆

克隆扩增得到AiRXR的cDNA含有两个亚型: AiRXRα和AiRXRβ, 异构体中长度最短的AiRXRα编码序列1338bp, 编码446个氨基酸, 理论的等电点为6.89, 软件预测蛋白为49.10 ku (http: //web. expasy.org/compute_pi/), AiRXRβ在AiRXRα的T-box 区域A 和V之间插入了4个氨基酸 (CLAA)。氨基酸序列比对显示AiRXR含有典型的RXR家族结构即含有两个保守的蛋白结构域: DNA结合结构域(DBD)和配体结合结构域 (LBD), DBD中含有P-BOX (EGCGK) 和D-BOX (CREER)。D区存在T-box (EAVQEERQR), E结构域中AF-2可激活RXR的转录活性(图1)。

2.2 同源序列分析和进化树分析

将克隆得到的AiRXR的DBD和LBD结构域分别与人 ()、斑马鱼 ()、小鼠()、爪蟾 () 和栉孔扇贝 () 等13个物种的22个 RXR氨基酸的DBD和LBD结构域进行同源比对, 发现AiRXRα和AiRXRβ与人和爪蟾的同源性均为79%~84%, 与栉孔扇贝RXR的同源性高达90% (图2)。

(, 光滑双脐螺, AAL86461)、(, 招潮蟹, AAC32789)、(, 大型蚤, ABF74729)、(, 斑马鱼, NP_571228)、(, 斑马鱼, NP_571313)、(, 斑马鱼, NP_001002345)、(, 陆地蟹, AAZ20368)、(, 人, ABB96254)、(, 人, AAA60293)、(, 人, AAA80681)、(, 东亚飞蝗, AAQ55293)、(, 静水椎实螺, AAW34268)、(, 小鼠, NP_035435)、(, 大西洋犬峨螺, ABS70715)、(, 大西洋犬峨螺, ABS70716)、(, 荔枝螺, AAU12572)、(, 爪蟾, P51128)、(, 爪蟾, NP_001080936)、(, 爪蟾, NP_001088948)、(, 栉孔扇贝, AFL91696.1)、(, 栉孔扇贝, AFL91697.1)、(, 栉孔扇贝, AFL91698.1)、-(, 栉孔扇贝, AFL91699.1)。P-box、D-box、T-box和AF-2用框架标记

利用MEGA5.0软件对AiRXR与其他13个物种的RXR的DBD和LBD部分结构域构建进化树, 发现AiRXR与栉孔扇贝RXR聚在一起, 并与其他软体动物聚为一大支, 与脊椎动物RXR分离开, 说明AiRXR属于RXR家族成员, 并且序列相对保守(图3)。

GenBank accession number:(AAL86461)、(AAC32789)、(ABF74729)、(NP_571228)、(NP_571313)、(NP_001002345)、(AAZ20368)、(ABB96254)、(AAA60293)、(AAA80681)、(AAQ55293)、(AAW34268)、(NP_035435)、(ABS70715)、(ABS70716)、(AAU12572)、(P51128)、(NP_001080936)、(NP_001088948)、(AFL91696.1) 、(AFL91697.1) 、(AFL91698.1)、(AFL91699.1)。海湾扇贝RXR用框架标记

2.3 海湾扇贝RXR在性腺不同发育时期各组织中的表达

荧光定量PCR用于检测AiRXR在性腺不同发育时期的表达, 结果表明, AiRXRα与AiRXRβ mRNA在性腺发育的五个时期: 分化期、增殖期、成熟期、排放期和休止期中均有表达, 但在性腺增殖期表达量最高(<0.05)。在性腺发育时期, AiRXR在组织中的表达差异显著(<0.05); 在发育时期的性腺组织中, AiRXR在增殖期的表达量最高, 并在成熟期、排放期和休止期中表达量迅速下降 (图4)。

3 讨论

本研究首次克隆获得海湾扇贝RXR基因(AiRXR)的cDNA 序列, 发现其含有2个RXR亚型: AiRXRα和AiRXRβ, 蛋白预测表明两个异构体之间插入一个相差12个核苷酸的T-box (+4)。在腹足类软体动物如[14]和[4]中也发现了相似的RXR的异构体。对其进行蛋白保守区预测, 显示其具有RXR核受体家族蛋白所具有的A-F区域的完整结构。从N 端到C 端, 海湾扇贝RXR氨基酸序列的C 区存在高度保守的P-box和D-box两个典型的结构, 其中P-box主要参与特异性结合DNA, D-box与同型二聚体的形成有关。D 区存在参与DNA 识别的T-box, 由于AiRXRα和AiRXRβ在T-box相差4个氨基酸序列, 因此AiRXRα和AiRXRβ在识别靶基因的位置存在差异。E/F结构域中的AF-2能够传递配体结合信号, 控制配体依赖的转录和激活[15]。

在脊椎动物中发现RXR与9-顺式维甲酸 (9cRA) 有较高的亲和力, 参与调控维甲酸信号途径, 并且在腹足类动物、和中也发现RXR可与9cRA结合[14, 16], 因此推测9cRA可能与AiRXR结合。目前已发现环境中的三丁基锡(TBT) 能够与人的RXR(hRXR)结合, 结合位点位于9cRA结合区; 疣荔枝螺()的RXR(TcRXR)与hRXR的LBD有相似的空间结构, 因此推测软体动物中TBT可能与TcRXR结合[17-18]。采用荧光素酶双报告技术研究发现TcRXR对外界的TBT有响应[4]。AiRXR是否参与海湾扇贝的三丁基锡应激反应, 尚待进一步的实验证实。

双壳类贝类中存在多种性腺发育的途径, 既有雌雄分化也有雌雄同体的形式, 由于性别分化的多样性, 因此研究双壳类性别分化和性别决定机制具有重要的价值[14]。本研究发现AiRXR在海湾扇贝性腺发育的5个时期均有表达并且在增殖期表达最高, AiRXR的表达趋势与杂色鲍的RXR表达一致[19]。这一发现说明软体动物RXR参与了细胞增值与分化的过程, 类似脊椎动物存在的作用[20], 而且也可据此推断RXR在调节性腺发育的过程发挥了作用。AiRXR在性腺发育时期的各组织中均有表达, 且在性腺中表达较高, 为AiRXR可能参与调节性腺发育提供了进一步的证据。影响软体动物性腺发育的温度、饵料、水质等生态环境因子是否会影响RXR的表达, RXR的表达调控作用与环境因子的关联性, 还有待进一步的研究[21-22]。

4 结论

本文报道了海湾扇贝RXR基因的cDNA序列及其在性腺发育不同时期的不同组织中的表达特点, 研究结果有助于阐明海湾扇贝性腺发育的分子机制, 丰富软体动物繁殖生物学和水产养殖学的知识, 为软体动物的性腺分化与发育分子机制的研究提供了重要的基础资料。

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(本文编辑: 梁德海)

Molecular cloning and expression of the retinoid X receptorgene in

ZHangRui1, 2, QUE Hua-yong1, CONG Ri-hao1, LI Li1, ZHANG Guo-fan1

(1. Institute of Oceanology of the Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

The retinoid X receptor (RXR) is a member of the nuclear family of receptors. It has been proven that RXR plays a crucial role in regulating growth, development, metabolism, and other physiological process in vertebrates. Using the RACE technique, the cDNA sequence ofRXR (AiRXR) was cloned. The ORF of AiRXR was 1338 bp. Two isoforms were confirmed as AiRXRα and AiRXRβ with a difference of four amino acids in the T-box. The homologous analysis of the amino acids showed that AiRXRs share a high degree of similarity with the RXRs ofand. The results of qRT-PCR illustrated that the AiRXR genes are expressed in multiple tissues (mantles, gills, gonads, and adductor muscles) throughout gonadal development, indicating that AiRXRs act as one of the signal molecules involved in multiple physiological processes. The highest level of AiRXR expression was observed at the proliferation stage of gonadal development, implying that AiRXR may be involved in the regulation of gonadal development and differentiation.

; AiRXR gene; tissue expression; gonadal development

Jan. 24, 2016

Q786

A

1000-3096(2016)09-0001-08

10.11759/hykx20160408003

2016-01-24;

2016-06-15

国家科技部高技术研发计划课题(863计划, 2012AA10A410); 贝类产业技术体系项目(CARS-48); 中国科学院科技服务网络计划项目(KFJ-EW-STS-060)

张瑞(1991-), 女, 满族, 吉林人, 硕士研究生, 从事海洋生物功能基因研究, 电话: 0532-82898695, Email: 13069312160@163.com; 阙华勇, 通信作者, 研究员, E-mail: hque@qdio.ac.cn

[Foundation: The National High Technology Research and Development Program, 863 Program, No.2012AA10A410; The Earmarked Fund for Modern Agro-industry Technology Research System, No.CARS-48; Science and Technology Service Network Initiative No.KFJ-EW-STS-060]