河北太行鸡含黄素单氧化酶3基因型频率分布研究

胡慧艳，贾 青,2⋆，孙凤莉，赵思思，锡建中，李晓敏

（1.河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071000；2.国家北方山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071000；3.河北省畜牧兽医研究所，河北 保定 071000）

河北太行鸡含黄素单氧化酶3基因型频率分布研究

胡慧艳1，贾 青1,2⋆，孙凤莉3，赵思思1，锡建中1，李晓敏1

（1.河北农业大学动物科技学院，河北 保定 071000；2.国家北方山区农业工程技术研究中心，河北 保定 071000；3.河北省畜牧兽医研究所，河北 保定 071000）

本试验旨在研究含黄素单氧化酶3（Flavin-Containing Monooxygenase 3, FMO3）基因T329S 突变在河北太行鸡群体中的分布。本研究根据GenBank 中公布的鸡FMO3 基因序列设计引物，采用PCR-RFLP 方法对517只河北太行鸡FMO3 基因频率及基因型频率进行检测。结果显示，该位点在河北太行鸡群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）；等位基因A、T 频率分别为0.9023、0.0976；AA、AT、TT 基因型频率分别为0.8201、0.1644、0.0155。结果表明，河北太行鸡群体中鱼腥味综合症易感基因型频率不高，可以通过PCR-RFLP 的方法予以剔除。

河北太行鸡；含黄素单氧化酶3基因；基因型频率；PCR-RFLP

含黄素单氧化酶3基因（flavin- containingmonooxygenase3，FMO3）又名鱼腥味基因，位于鸡8号染色体。诸多研究表明，FMO3基因存在多态性，这种多态性不仅存在于人类也存在于动物中。该基因第七外显子上第694位碱基由A突变为T，从而引起329位氨基酸由苏氨酸（T）突变为丝氨酸（S），故将该位点定义为T329S。Vondel l[1]首次对鱼腥味鸡蛋进行了报道，鸡蛋鱼腥味的产生与FM O 3基因上的一个非同义突变（Nonsynonymous mutation），即T329S位点密切相关，这个突变位点改变了该基因进化上的一个高度保守五肽基序FATGY，造成三甲胺（Trimethylamine，TMA）氧化能力降低，引起三甲胺的沉积。

在蛋鸡生产中，由于饲料来源广泛，可能含有TM A或其前体物质，带有这种基因缺陷的蛋鸡体内的三甲胺不能正常代谢，从而导致了三甲胺在鸡蛋中沉积而产生了鱼腥味鸡蛋[2]。研究报道，三甲胺主要存在于蛋黄中，携带鱼腥味鸡蛋蛋黄中TM A的含量为正常鸡蛋蛋黄中含量的10倍[3]，鱼腥味严重降低了鸡蛋的品质和口感。张龙超[4]、Chu等[5]、邱家维等[6]分别对我国不同地方鸡种FM O 3基因T329S位点基因型分析表明部分地方鸡品种有携带鱼腥味的个体。对于饲养量众多的河北太行鸡未见其研究报道。本研究旨在检测FM O 3基因T329S突变位点在太行鸡群体中的分布，对于剔除携带鱼腥味敏感基因的个体，为太行鸡的改良和选育提供基础资料。

1 材料与方法

1.1 样品采集 本试验所选取的河北太行鸡均为纯种。血样采集在翅下静脉，约0.5 mL，采用ACD抗凝剂对血液进行抗凝，共计422个样品。肝脏组织样品采集约0.5 g，放入1.5 mL Eppendorf管中，收集肝脏样品95个。置于-20℃冻存备用。

1.2 引物设计 据GenBank中鸡FM O 3的基因序列（登录号AJ 431390），获得含T329S突变位点的序列信息。应用Pri m er Prem i er 5引物设计软件，针对T329S位点设计引物，引物由北京华大科技公司合成。所用引物序列为：

1.3 PPCCRR反应 本试验均采用10 μL PCR反应体系：dd H20 7.1 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，（2.5 mm）dN TPs 0.8 μL，（10 μM）上下游引物各0.2 μL，Taq DN A聚合酶（5 U/μL）0.2 μL，（100 ng/μL）DN A模板0.5 μL。PCR反应程序为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s，退火温度67℃退火30 s，72℃延伸45 s，30个循环；最后72℃延伸10 min。取2 μL PCR扩增产物与1 μL 6×溴酚蓝上样缓冲液混匀，点样于1.5%琼脂糖凝胶（含0.05%GV），电泳检测，并在凝胶成像系统下观察PCR扩增情况。

1.4 酶切反应体系 采用PCR-RFLP方法检测太行鸡个体FM O 3基因的基因型，限制性内切酶为Bsr I，该内切酶所切序列为：5’-ACTGGN↓-3’，3’-TGAC↑CN-5’，其中箭头所指位置为酶切位点。PCR-Bsr I酶切总体系为10 μL，酶切体系为：灭菌dd H2O 4 μL，10×Buffer 0.5 μL，PCR产物5 μL，Brs I限制性内切酶（10 U/μL）0.5 μL。酶切温度为67℃，时间为2 h。PCR产物酶切完成后，经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测。并在凝胶成像系统下观察、拍照。

1.5 统计分析 根据PCR-RFLP检测结果，采用PO PGEN E软件计算河北太行鸡群体该基因位点基因型频率、等位基因频率、观测杂合度（H O）、期望杂合度（H e）、有效等位基因数（N e）及多态信息含量（PIC）；采用SPSS 19.0中的卡方检验进行哈代-温伯格（H ardy-W ei nberg）平衡性检测。

图1 基因组DNA凝胶检测Fig.1 Electrophoresis products of Genome DNA

2 结果与分析

2.1 基因组DDNN AA提取 样品基因组DN A提取均参照血液基因组提取试剂盒说明书进行。基因组DN A经琼脂糖凝胶电泳检测条带单一、整齐、清晰，亮度较好，无降解现象，即基因组DN A的完整性好，见图1。采用N ano Drop 2000超微量分光光度计对提取的基因组DN A进行浓度和纯度检测，其比值（O D260/O D280）在1.8～2.0之间，可直接用于后续PCR、酶切等下游试验。

2.2 PPCC RR扩增 取2 μL PCR扩增产物，点样于1.5%琼脂糖凝胶（含0.05%GV），电泳检测，并在凝胶成像系统下观察PCR扩增情况，如图2所示，PCR扩增产物大小与预期片段（369 bp）大小一致，为目的片段，且没有特异性扩增条带，可直接用于PCR-RFLP分析。

图2 FMO3基因PCR扩增结果Fig.2 Products of FMO3 gene by PCR

2.3 PCR--RRFFLLPP分析 PCR产物酶切完成后，经2.0%的琼脂糖凝胶电泳检测，FM O 3基因PCR产物酶切后的琼脂糖凝胶检测结果如图3所示，参考电泳图谱，可以根据带型对太行鸡个体进行基因型分型，若为226 bp、143 bp两条带，即判定为AA型；若为369 bp、226 bp、143 bp三条带，即判定为AT型；若为369 bp一条带，即判定为TT型。

图3 FMO3基因突变位点的PCR-RFLP检测结果Fig.3 Identification of polymorphism site by PCR-RFLP

2.4 基因型频率及等位基因频率 对采集的517只太行鸡血液和肝脏样品DN A进行FM O 3基因T329S突变位点基因型频率与基因频率分析，结果如表1所示。

从表1可知，在河北太行鸡群体中，AA基因型和AT基因型频率显著高于TT基因型，A等位基因频率显著高于T等位基因频率。经卡方检验，卡方值为2.052（P＞0.05），说明所检测河北太行鸡群体在此位点处于H ardy-W ei nberg平衡状态，见表2。

2.5 遗传变异参数 杂合度、多态信息含量是度量群体遗传变异的参数。该群体的观测杂合度（H O）为0.1644，期望杂合度（H e）为0.1763、有效等位基因数（N e）为1.2140，多态信息含量（PIC）为0.1607，由此可知，该群体在该基因位点上均处于低度多态（PIC＜0.25），因而将携带鱼腥味综合征易感基因纯合型（TT）和杂合型（AT）个体从群体中剔除相对较容易。

3 讨论

表1 河北太行鸡FMO3基因频率及基因型频率Table1 Frequencies of genotype and allele of FMO3 gene in Taihang chickens of Hebei

表2 FMO3基因T329S位点Hardy-Weinberg平衡检验Table2 Hardy-Weinberg equilibrium test for T329S site of FMO3 gene

我国地方禽类品种资源丰富，地方品种在肉蛋品质及风味上优于高产商业品种。本研究中太行鸡主产于河北境内，经人工选择形成的河北省优良地方品种，其蛋肉品质优良，营养成分含量丰富，深受消费者欢迎。但新鲜鸡蛋中有时会出现一种类似臭鱼的难闻味道，即所谓的“鱼腥味综合征”，严重影响消费者的感官感受。研究证实，FM O 3是体内三甲胺（TM A）代谢的唯一有效酶[7]，FM O 3基因T329S突变位点引起FM O 3活性降低是导致产生腥味蛋的遗传因素。

关于FM O 3基因T329S突变位点在不同品种鸡群体中已有不少研究报道，因遗传背景及选育程度不同，T329S突变位点在各个鸡品种中的分布也不尽相同。张龙超[4]采用PCR-RFLP方法分析了我国地方鸡种包括白莱航蛋鸡、东乡绿壳蛋鸡和H褐壳蛋鸡鸡种FM O 3基因T329S突变位点的分布，该结果表明部分地方鸡种有携带鱼腥味的个体；刘伟等[8]研究的安徽地方鸡种中鱼腥味敏感基因型频率均在0.05以下；邱家维等[6]、陈强等[9]、Chu等[10]报道的林甸鸡、绿壳蛋鸡、北京油鸡群体中均存在鱼腥味综合征易感基因型个体，不利等位基因T的基因频率分别为0.005～0.25，王晓亮等[11]对10个地方鸡种的研究发现均存在鱼腥味综合征易感个体，但易感基因型频率都不高，可以采用PCR-RFLP方法剔除。本试验中，所研究的太行鸡群体中TT基因型频率为0.0155，T等位基因的频率为0.0976，由此可见，河北太行鸡群体中鱼腥味综合征易感基因型频率较小。因此，对河北省优质太行鸡种FM O 3基因T329S突变位点进行筛查，对携带该基因的杂合子及纯合子予以剔除，从而从遗传上保证太行鸡群体中不再出现产鱼腥味鸡蛋的个体，最终建立无鱼腥味基因的地方品种具有重要的意义。

[1]Vondell J H. Is the production of “off- flavor”eggs an individual characteristic[J].Poultry Sciences, 1932, 11: 373.

[2]Honkatukia M, Reese K, Preisinger R, et al.Fishy taint in chicken eggs is associatedwith a substitution within a conserved motifof the FMO3 gene[J]. Genomics, 2005, 86(2):225-232.

[3]Hobson-frohock A, Land D G, Griffiths N M, etal. Egg taints: association with trimethylamine[J]. Nature, 1973, 243: 304-305．

[4]张龙超.鸡蛋品质性状遗传参数及相关候选基因研究[D].北京：中国农业大学，2007.

[5]Chu Q, Zhang J, Zhu S, et al. The detectionand elimination of flavin-containing monooxygenase3 gene T329S mutation in the BeijingYou chicken[J]. Poultry science, 2013, 92(12): 3109-3112.

[6]邱家维，王志鹏，张元良，等.林甸鸡玫瑰冠、鱼腥味和矮小性状的遗传基础分析[J].中国家禽，2015，37（14）：7-12.

[7]LANG D H, YEUNG C K, PETER R M, et al. Isoformspecificity of trimethylamine N- oxygenationby human flavin- containing monooxygenase(FMO) and P450 enzymes:selective catalysisby FMO3[J]. Biochemical Pharmacology,1998, 56(8): 1005-1012．

[8]刘伟，詹凯，李俊营，等.安徽部分地方禽种FMO3 基因频率分布研究[J].中国家禽，2014，66（5）：11-13

[9]陈强，杨帆，白春艳，等.绿壳蛋鸡FMO3 基因多态性PCR-RFLP 检测方法研究[J].中国家禽，2010，32（21）：9-13.

[10]Chu Q, Zhang J, Zhu S, et al. The detectionand elimination of flavin-containing monooxygenase3 gene T329S mutation in the BeijingYou chicken[J]. Poultry science, 2013, 92(12): 3109-3112.

[11]王晓亮，徐桂云，郑江霞，等.中国11 个地方鸡种中鱼腥味敏感基因FMO3 基因型频率分布研究[J].畜牧兽医学报，2010，41（11）：1497-1501.

Genotype Frequencies of Flavin-Containing Monooxygenase 3 in Taihang Chickens of Hebei

Hu Hui yan1,Jia Qing1,2*,Sun Fengli3,Zhao Sisi1,Xi Jianzhong1,Li Xiaomin1
(1.College of Animal Science and Technology, Agricultural University of Hebei, Hebei Baoding 071000;2.National Engineering Research Center for Agriculture in Northern Mountainous Areas, Hebei Baoding 071000;3.Husbandry and Veterinary Research Institute of Hebei, Hebei Baoding 071000)

The objective of the study was to detect the distribution of Flavin-Containing Monooxygenase3(FMO3) T329S mutation in Taihang Chickens of Hebei. In the experiment, primers were designedaccording to FMO3 gene sequences in GenBank database. PCR-RFLP technique was used for detectingthe T329S polymorphism site of FMO3 gene in 517 Taihang Chickens. The result of c2testshowed that the polymorphic site of FMO3 gene was fit with Hardy-Weinberg equilibrium in TaihangChickens of Hebei (P>0.05), The allele frequencies of A, T were 0.9023, 0.0976; the frequenciesof AA, AT and TT genotype were 0.8201, 0.1644 and 0.0155, respectively. The research result hasshowed that the frequency of fishy taint genotype was generally low and the susceptible individualscould be easily detected by PCR-RFLP method in the Taihang Chicken of Hebei.

Taihang Chickens; Flavin-Containing Monooxygenase 3 gene; Genotype Frequencies; PCRRFLP

S831.2

B

1672-9692(2016)03-0008-05

2016-01-19

胡慧艳（1989-），女，硕士，研究方向为动物遗传育种与繁殖。

贾青（1964-），男，教授，博士，博士生导师，主要从事动物遗传育种研究。

河北省科技计划项目（14236602D）。