鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜修复周围神经损伤的实验研究

崔 军 莫忆南沈阳医学院附属中心医院，辽宁沈阳 110024

鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜修复周围神经损伤的实验研究

崔 军 莫忆南
沈阳医学院附属中心医院，辽宁沈阳 110024

目的 探究鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜在周围神经损伤修复中的应用价值。 方法 取4～6周龄雄性SD大鼠72只制备坐骨神经损伤模型，随机分为4组各18只，分别对神经吻合口部位行鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜包绕（A组）、鹿茸多肽-PLGA复合膜包绕（B组）、FK506-PLGA复合膜包绕（C组）以及直接端端吻合（D组），比较各组大鼠术后2、4、6周小腿三头肌诱发电位恢复率及其再生有髓纤维计数（n）、直径（mm）及截面积恢复率（%）情况。 结果 术后各时点A组大鼠电位恢复率明显优于B、C、D组（P均＜0.05），且B、C组大鼠电位恢复率也较对照组D组具有明显改善。术后2、4、6周时，A组大鼠再生有髓纤维数、直径及截面积恢复率均明显优于B组、C组、D组（P均＜0.05），D组的再生有髓纤维数、直径及截面积恢复率较B、C组均明显偏低，差异有统计学意义（P＜0.05）。 结论 鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜可有效促进周围神经缺损的再生和修复，在保证外周神经有效营养供给的同时提供良好的生物相容性。

鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜；周围神经损伤

周围神经损伤是临床上常见的功能性损伤分类之一，其修复往往需要较长的过程，如何有效靶控再生神经对效应器官的调节作用仍是创伤修复领域的研究热点[1]。鹿茸多肽含有丰富的蛋白质、氨基酸及钙离子，可有效促进轴浆蛋白质和RNA的合成，帮助损伤神经的修复[2]。 FK506作为一种大环内酯类抗生素，不但具有常规的强效抗菌作用，同时还具有强大的促神经再生作用，使得其备受神经损伤修复专家的关注和亲睐[3]。本实验主要针对鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜在外周神经损伤修复中的效果进行研究，现报道如下。

1　材料与方法

1.1实验动物分组

雄性SD大鼠72只（4～6周龄），体重（250±50）g（中国医科大学实验动物中心）。所有动物随机分成4组，各18只，A组VAP-FK506-PLGA复合膜修复组（4.55±0.22）周龄，体重（267.42±11.42）g；B组VAP-PLGA复合膜修复组（4.28±0.31）周龄，体重（264.32±12.01）g；C组：FK506-PLGA复合膜修复组（4.47±0.31）周龄，体重（273.41±11.83）g；D组（4.48±0.27）周龄，体重（272.13±12.81）g。

1.2复合膜制备

VAP-PLGA复合膜：将10mg的鹿茸多肽与1g的PLGA混合后，制成厚度50μm的复合膜，并应用环氧乙烷消毒备用[4]。

VAP-PLGA-FK506复合膜：将10mg的鹿茸多肽、5mg FK506与1g的PLGA混合成厚度50μm复合膜，消毒同上。

FK506-PLGA复合膜：分别将5mg FK506与1g的PLGA混合成厚度50μm复合膜，消毒同上。

1.3动物模型制备

采用1%硫喷妥钠以5mL/kg对SD大鼠进行腹腔注射麻醉，俯卧位固定，碘伏消毒左下肢术区[5]。于股后方做一长约30mm的弧形切口至皮下，钝性分离显露梨状肌、股二头肌及坐骨神经[6]。充分显露神经后，游离分离出长约20mm神经。A组剪下游离端3mm，待其自行收缩形成约5mm神经缺损后，将VAP-FK506-PLGA 膜修剪成约 10mm×10mm大小的适应形状对神经断端进行包裹，并缝合固位。最后对已缝合固位的复合膜进行加固缝合，注意固定薄膜游离缘与外膜中间部分并形成闭合导管。B、C组造模同上。D 组在梨状肌下缘 5mm 处切断坐骨神经后行端端直接吻合。

1.4观察指标

（1）电生理检测：肌电仪测定实验侧肢体坐骨神经支配的小腿三头肌最大诱发电位，比较其与对侧恢复率。（2）组织学检查：取坐骨神经缝合口近端神经组织制备常规切片观察HE染色下实验侧肢体做有髓神经纤维计数、神经直径、神经截面积与正常侧的恢复率情况。

1.5统计学处理

2　结果

2.1各组大鼠术后小腿三头肌诱发电位恢复率情况

术后各时点，A组电位恢复率均明显高于其他各组（P均＜0.05），且B、C两组的大鼠电位恢复率也较D组明显偏高，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表1。

表1　各组大鼠术后小腿三头肌诱发电位恢复率

表1　各组大鼠术后小腿三头肌诱发电位恢复率

组别　n　　术后2周　　术后4周　　术后6周　F　P A组　6　9.32±1.31　17.42±4.31　52.31±6.53 5.0324＜0.05 B组　6　5.41±1.34　14.31±3.81　40.53±5.21 4.9373＜0.05 C组　6　5.21±1.53　14.29±3.90　41.36±5.36 4.7783＜0.05 D组　6　1.32±0.42　7.53±3.15　31.42±3.05 4.3743＜0.05 F 5.4243　5.4113　5.2436 P＜0.05　　＜0.05　　＜0.05

2.2各组大鼠神经再生情况比较

术后2周、4周、6周时，A组评价再生有髓纤维数、再生有髓纤维直径以及其截面积恢复率均明显优于B、C、D组（P均＜0.05），且各组术后4周、6周的再生有髓纤维数、直径及截面积恢复率较术后2周均具有明显差异（P均＜0.05）。见表2。

表2　各组大鼠神经再生情况比较

表2　各组大鼠神经再生情况比较

组别　n再生有髓纤维数　　再生有髓纤维直径（mm）　　再生有髓纤维截面积恢复率（%）术后2周　　术后4周　　术后6周　F　P　　术后2周　　术后4周　　术后6周　F　P　　术后2周　　术后4周　　术后6周　F　P A组　6　20.32±4.54 54.56±5.31　80.22±5.14　5.8243＜0.05　36.43±5.64　60.01±3.45　78.31±4.32　5.4732　＜0.05　21.31±4.62 60.03±6.37 80.12±3.45　5.0245　＜0.05 B组　6　15.21±4.21 41.24±5.12　72.66±5.31　5.4372　＜0.05　20.83±4.29　47.74±3.45　73.45±2.56　4.2553　＜0.05　15.32±5.10 54.12±2.35 64.06±5.10　4.3252　＜0.05 C组　6　15.38±3.21 40.32±4.83　72.31±5.24　5.3252＜0.05　20.34±4.53　47.03±4.19　73.53±3.42　4.3824　＜0.05　15.32±2.01 53.33±3.01 63.53±4.64　5.2110　＜0.05 D组　6　9.56±l.97　24.96±3.67　58.98±1.58　4.7535　＜0.05　8.32±10.65 41.32±2.45　51.22±2.54　4.8732　＜0.05　4.64±1.36 39.54±3.81 56.14±3.78　4.3753　＜0.05 F 4.5353　5.8435　5.3392　4.9985　5.0332　5.4855　4.3357　4.2845　5.0332 P＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05　　＜0.05

3　讨论

周围神经损伤主要指神经细胞的轴突损伤，当正常神经细胞轴突双向传递过程受到抑制时，神经干的连续性就会受到影响，随着病程的进展，神经元细胞还可出现不可逆的损伤并最终趋于死亡。周围神经损伤修复一直是临床上的难点问题，自20世纪末生物工程手段在周围神经损伤的修复中成功应用以来，近年来不断有基于生物工程材料的治疗方案提出[7]。

鹿茸多肽（Velvet Antler Peptide，VAP）是一种来自于天然鹿茸，且富含氨基酸的多肽类生物活性物质，含有神经生长和修复所需的多种生长因子，能在一定程度上模拟神经干细胞分化的外环境，并明显促进神经干细胞向神经元进行高效分化[12]。有研究指出，鹿茸多肽可有效促进轴浆蛋白质和RNA的合成，同时还可有效促进单核巨噬细胞的活性，提高患者免疫功能，有效清除变性神经和坏死神经中的有害物质[8]。FK506（他克莫司）是一种从链霉菌中分离出的大环内酯类抗生素，最初主要应用于器官移植术的抗感染治疗，近年来有学者发现FK506还具有一定的促神经再生作用，可通过作用于神经再生相应的营养因子和诱导因子，有效恢复神经干的信号传导连续性[9]。笔者在动物坐骨神经损伤的模型研究中，分别予以VAP -PLGA-FK506联合复合膜、VAP-PLGA复合膜、FK506-PLGA复合膜以及空白对照予以修复治疗，比较其术后2周、4周、6周时的三头肌诱发电位恢复率和再生有髓纤维情况发现，A组大鼠上述各项指标均明显优于其他各组，且B、C组大鼠的神经再生情况，也较空白对照组大鼠明显偏优，提示鹿茸多肽以及FK506均可在一定程度上促进损伤神经的修复，且二者联合使用具有更高的再生神经修复优势，可互补不足，在为外周神经再生提供稳定而有效的应用成分的同时，明显促进轴突的再生活性，并有效保障损伤神经的修复和再生[10]。

综上所述，鹿茸多肽-FK506-PLGA复合膜对于损伤神经的修复具有积极意义，鹿茸多肽和FK506均可在一定程度上促进神经轴突再生，联合使用具有更高的有效率和更广的安全窗。

[1] 王克利，路来金，张静玲.聚乳酸和聚羟基乙酸共聚物复合膜修复坐骨神经损伤[J].中国组织工程研究与临床康复杂志，2012，34（16）：6307-6311.

[2] Ding T，Luo ZJ，Zheng Y，et al.Rapid repair and regeneration of damaged rabbit sciatic nerves by tissueengineered scaffold made from nano-silver and collagen type I[J].Injury，2010，41（5）：522-527.

[3] 李振华，赵文海，周秋丽.鹿茸多肽对抗骨关节炎软骨细胞氧化损伤作用的实验研究[J].中国骨伤，2011，24（3） ：245-248．

[4] Si YC，Li Q，Xie Ce，et al.Chinese herbs and their active ingredients for activating xue （ blood ） promote the proliferation and differentiation of neural stem cells and mesenchymal stem cells[J].Chin Med，2014，9（1）：13.

[5] 王克利，路来金，张静玲，等.鹿茸多肽复合膜提供周围神经再生的微环境[J].中国组织工程研究，2013，17（25）：4652-4659.

[6] 李振华，赵文海，周秋丽.鹿茸多肽对抗骨关节炎软骨细胞氧化损伤作用的实验研究[J].中国骨伤，2011，24（3）：245-248.

[7] 修忠，江陟郝，孙磊.鹿茸多肽干预膝骨性关节炎软骨细胞的增殖[J].中国组织工程研究与临床康复，2011，15（24）：4448-4458.

[8] 中华人民共和国国家药典委员会.中华人民共和国药典[S].北京：化学工业出版社，2010.

[9] 刘春娟.不同分子量鹿茸多肽抗氧化活性的研究[J].食品工业科技，2015，36（13）：53-56.

[10] Gilbev A，Perezgonzalez JD.Health benefits of deer and elk velvet antler supplements： a systematic renewof randomised enntrnlled studies[J].N Z Med J，2012，125（1367）：80-86.

The research of pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane in the repair of peripheral nerve injury

CUI Jun MO Yinan
Center Hospital Affiliated to Shenyang Medical School, Shenyang 110024, China

Objective To explore the application value of pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane in the repair of peripheral nerve injury. Methods 72 male SD rats (4-6 weeks) were selected to build sciatic nerve injury model, and they were divide into 4 groups, with 18 cases in each. Rats in group A were treated with nerve anastomosis with pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane, rats in group B were treated with deer antler polypeptide - PLGA composite film bag, rats in group C were treated with FK506 around -PLGA composite membrane, and rats in group D were treated with end to end anastomosis. The leg triceps evoked potential recovery rate, regenerative myelinated fibers count (n), diameter (mm) and cross-sectional area recovery rate (%) after 2, 4, 6 weeks in different groups were compared. Results The potential recovery rate in group A in different points were significantly better than that in group B, C and D(P＜0.05)， and the potential recovery rate in group B and C were better than that in group D. At 2, 4, 6 weeks postoperatively, the regenerative myelinated fibers count, diameter and cross-sectional area recovery rate in group A were significantly better than those in group B, C and D (P＜ 0.05), and the regenerative myelinated fibers count, diameter and cross-sectional area recovery rate in group D were significantly lower than those in group B and C. Conclusion Pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane can effectively promote the regeneration of the peripheral nerve defect effectively, and support a good biocompatibility as well as effective nutrient supply.

Pilose antler polypeptide - FK506 - PLGA composite membrane; Peripheral nerve injury

R285.5

A

2095-0616（2016）17-30-03

（2016-07-06）