亲和分离技术中亲和配基的研究进展

曾嵘靳步昆阮涛吴优侯亚利龚志伟杨忠华

（1. 湖北大学化学化工学院，武汉 430062；2. 武汉科技大学化学工程与技术学院，武汉 430081）

亲和分离技术中亲和配基的研究进展

曾嵘1靳步昆2阮涛2吴优2侯亚利2龚志伟2杨忠华2

（1. 湖北大学化学化工学院，武汉 430062；2. 武汉科技大学化学工程与技术学院，武汉 430081）

亲和分离技术在蛋白质的分离纯化过程中发挥着越来越重要的作用，开发合适的配基是亲和分离的关键。按生物大分子亲和配基、小分子亲和配基、金属亲和配基三大类对亲和配基的研究情况进行综述，重点介绍其发展现状、作用机理以及目前存在的主要问题，并对亲和配基未来发展进行展望，旨为将其更好地应用于实际生产。

亲和；纯化；层析；配基；特异性吸附

伴随着生命科学与生物工程等相关学科的快速发展，特别是基因工程取得的巨大成就，人们对生物产品下游加工过程中蛋白质的分离纯化提出了更高的要求。亲和分离是通过与目标蛋白特异性结合，达到从复杂的生物产品中一步纯化得到目标产物的技术，它具有高效简便的优点，已广泛应用于抗原、抗体、激素、糖蛋白、核酸、多糖及抑制剂等产品的分离纯化［1］。

亲和分离技术包括亲和色谱、亲和膜、亲和过滤、亲和萃取、亲和电泳等多种分离技术［2］。其中亲和色谱与亲和膜技术已广泛应用于蛋白质的分离纯化过程中。在亲和分离技术中，亲和分离介质是亲和分离的基础。亲和分离介质主要由载体、间隔臂、亲和配基三部分组成，在合适的载体上连上间隔臂，再在间隔臂的另一端连接能与目标蛋白特异性结合的亲和配基。其中亲和配基的选择对整个亲和分离过程起着决定性的作用。亲和配基需与目标蛋白高效、特异性、可逆结合，主要包括生物大分子类、小分子类、金属类亲和配基。其中生物大分子类亲和配基与目标蛋白特异性识别能力最强，小分子类与金属类亲和配基与目标蛋白的识别能力相对较弱，但价格低廉、来源较广，是目前研究较广泛的领域。本文针对生物大分子、小分子、金属三大类亲和配基的发展，作用机理，在纯化蛋白中的应用以及存

在的问题，解决方案进行阐述，并展望亲和配基的改进和发展趋势，旨为将其更好地应用于实际生产。

1 生物大分子亲和配基

生物大分子亲和配基是自然界中存在的具有生物特异性相互作用的物质，具有较高的特异性，包括酶与相应的底物和抑制剂、激素与受体。常见的有细菌蛋白质、免疫、凝集素、多糖、多肽等亲和配基。该类配基能与目标蛋白高效性结合，可用于组织纤溶酶原激活剂、干扰素、抗体、抗原、胰蛋白酶、糖蛋白、脱氢酶及激酶等物质的分离纯化。

图1 亲和分离过程

1.1 细菌蛋白类亲和配基

细菌蛋白类配基是一种由细菌体内分离出来的蛋白，包括蛋白A、蛋白G，分别来源于金黄色葡萄球菌和G群链球菌。它们对具有Fc片段相似结构的抗体有较强的亲合作用，并且纯化的抗体有较高的活性。常用于固定细菌蛋白类配基的载体有纤维素、聚醚砜、聚偏氟乙烯等。

吴璞强［3］通过重组菌构建，对金黄色葡萄球菌蛋白A亲和配基的分子进行了改造。并制备了具有洗脱条件温和、耐高浓度碱的重组蛋白A亲和填料，将其应用于牛初乳IgG的纯化。唐思远［4］采用Protein A亲和层析和DEAE阴离子交换层析两步法制备了较高纯度的Fab片段和Fc片段，考察了混合模式层析介质对两种片段的吸附差异，实现了混合模式层析分离抗体片段。研究结果有助于开发抗体片段制备的新工艺，以及探讨混合模式层析分离抗体的机制研究和配基优化设计。

细菌蛋白类亲和配基特异性高，但配基与载体价格昂贵，不适用于医疗蛋白的工业化生产，且在纯化过程中配基容易泄露影响产品纯度。为了降低成本，提高产物的纯度，开发出廉价的亲和载体、利用重组技术对细菌蛋白进行改造、或模拟细菌蛋白类亲和配基是有效的策略。黄波等［5］用分子动力学模型与自由能分解的方法对蛋白A与人免疫球蛋白G1的结合机理进行研究，发现疏水作用在它们的结合中起了较大的作用，该研究有助于模拟蛋白A 配基的合成。EI Khoury 等［6］根据链状球菌蛋白G的Fab区域人工合成了一种吸附剂A2C7I1，它含有与链状球菌蛋白G相似的关键氨基酸残基，对哺乳动物、酵母的IgG和Fab碎片蛋白的纯化纯度均达到93%。

蛋白A亲和层析是抗体分离的平台技术，具有高度特异性，但是存在成本高、洗脱条件苛刻、蛋白配基易脱落等问题。寻求经济高效的抗体分离新方法，具有重要的意义。混合模式层析和短肽仿生层析是目前抗体分离的新技术，但对其的认识还不够深入。

1.2 免疫类亲和配基

抗体与抗原之间能够发生免疫反应，以一方作为亲和配基可以分离对应的目标蛋白。研究表明抗体与抗原之间具有互补的空间结构，是由静电力、范德华力、疏水力等综合作用结合，选择性和结合力优于一般的配基。Mei等［7］制备多克隆抗体免疫色谱柱可以从动物肝脏中特异性结合苯基乙醇胺，达到分离提纯的目的。

相较于多克隆抗体，单克隆抗体针对某一抗原决定簇，能产生唯一稳定的产物并且与抗原之间具有独特解离常数，得到更多的应用。王明永等［8］联合抗人MBL-CRD单克隆抗体与甘露聚糖-Sepharose层析柱，分离纯化人血浆中的甘露聚糖结合凝集素，获得了高纯度、高活性的天然蛋白。Hu等［9］制备了单克隆抗体Mab 4B2免疫亲和色谱，成功的纯化了大豆中的大豆球蛋白。

免疫亲和配基能够高效的识别目标蛋白，不但可用于分离纯化多克隆抗体中微量的抗原，还可以用于微量物质的检测，特别是与膜技术现结合，经一次简单处理便得到高纯度的活性物质。但是获得高纯度的抗体或抗原增加了纯化步骤与成本，在洗脱过程中容易失活。

1.3 凝集素类亲和配基

凝集素是指从各种植物、无脊椎动物和高等动物中提纯的结合糖蛋白，含有一个或多个可与单糖或寡聚糖特异性可逆结合的结构，可用于纯化糖基化的分泌蛋白和膜蛋白，包含多糖、糖酯、糖蛋白、及含糖配基的生物大分子，也可用于蛋白质组学的结构分析。

凝集素亲和色谱与质谱技术结合到一起常用于蛋白组学信息的研究，Ruiz-May 等［10］利用凝集素亲和层析纯化N-糖蛋白，进一步利用质谱对蛋白结构进行了分析。杨彦杰等［11］运用ConA凝集素固相亲和层析、双向电泳与质谱等技术对大鼠的再生肝糖蛋白质组学进行了研究，鉴定出了123种蛋白。

为了确定与目的糖蛋白特异性结合的凝集素，可以通过已有的研究进行分析，如王志凤［12］利用植物凝集素亲和层析，分离纯化了小黑杨雄花芽、雌花芽和叶芽3种组织糖基化蛋白，并对蛋白质组学信息进行了研究。路垚等［13］制备了两种亲和树脂载体，连接蓖麻凝集素，分离纯化了金花茶多糖。时照梅等［14］利用氧化石墨烯中固定凝集素，成功的用于糖蛋白与糖肽的富集，在蛋白质组学中具有很高的应用价值。另外商业化的试剂盒中包含一系类固定化凝集素，可快速筛选能与目的蛋白结合的凝集素促进凝集素技术的发展。

1.4 多糖类亲和配基

多糖类材料包括琼脂糖、葡聚糖、纤维素及壳聚糖等大分子物质，它们具有亲水多孔的结构、比表面积大、物理化学稳定性高、含有羟基及氨基等多种活性官能团、能发生酰基化、磺化、羟甲基化、羧甲基化等化学反应、生物特性较好，并且来源广泛、价格低廉、可循环利用等优点，是一种理想的亲和载体与配基，将其制备成亲和膜已经得到广泛应用。

多糖类材料多存在于农作物秸秆中，童贤涛［15］等采用新型纤维素溶解体系NaOH/硫脲/尿素体系作为溶剂，对纤维素进行溶解、过滤、脱泡，得到澄清的纤维素溶液，然后通过H2SO4、CH3COOH、H2SO4/Na2SO4等不同的凝固浴制备出了具有均匀致密的孔洞结构纤维素膜，为纤维素膜的进一步应用打下基础。为了提高造膜的稳定性与识别能力，可以对亲和膜表面进行化学改造，王蕊［16］以纸纤维为基材，通过接枝改性获得纸基疏水色谱分离膜，并考察所得分离膜对混合蛋白的分离性能。符瑞［17］采用超支化方法对纤维素膜进行表面改性，通过在表面引入更多的功能基团，增加吸附位点来提高蛋白的吸附量，制备了一种对于金属离子和蛋白都有较高吸附量的超支化固定金属离子亲和膜。同时研究了该改性膜对蛋白的吸附性能，并将其用于含组氨酸标签蛋白的分离纯化。

壳聚糖也是一种重要的多糖类亲和材料，广泛用于亲和分离过程，Zeng等［18］利用乙二醇二缩水甘油醚对制备的大孔壳聚糖膜进行交联改性，可以用于吸附（等电点）pI＜6的蛋白。对卵白蛋白（pI=4.6）、人血清蛋白（pI=4.8）、大豆胰蛋白酶抑制剂（pI=4.5）的吸附量分别达到19 mg/mL、11.6 mg/mL、20.8 mg/mL。王苍［19］利用点击化学对亲和膜表面的糖基化进行构建，制备了高密度的糖基化层，具有糖苷集簇效应，提高了糖基对蛋白的结合与识别能力。

1.5 多肽类亲和配基

多肽类配基一种较理想的亲和配基，它由一些氨基酸组成，脱落后不会引起免疫反应。多肽配基比抗体配基更稳定，它们能进行大规模无菌生产，降低了成本。与金属和染料类配基相比，多肽配基特异性更高且具有无毒的特点。多肽与蛋白质相互作用条件温和，具有分离条件温和等优点，能避免蛋白质的变性。

朱俐燕［20］通过纳米球表面氨基的引入，成功地将肽配基 HWRGWV偶联于纳米球表面，合成了具有抗体定向固定功能化的纳米球。考察了功能化纳米球对猪IgG的吸附行为，进而利用ITC研究了功能化纳米球与IgG的相互作用。王荣柱［21］采用

混合模式层析分离方法高效分离抗体，通过抗体选择性比较引出短肽配基，探讨配基-抗体相互作用，设计和筛选高亲和力的四肽配基，评价吸附性能，实现复杂料液中高效分离抗体。研究结果有助于深入了解混合模式层析和短肽仿生层析的抗体分离模式，为新型配基设计和分离过程优化提供指导。

自然界中存在能与生物大分子特异性结合的多肽种类有限，因此需要人工模拟合成多肽类似物。通常确定了目标蛋白的晶体结构，利用计算机模拟与组合化学的方法可以合成多肽类配基。赵勇山等［22］利用同源膜建和分子动力学模拟方法构建了人类丝氨酸消旋酶的三维结构，运用分子对接程序将多肽类抑制剂与人类丝氨酸消旋酶进行对接，研究了它们之间具体结合方式，确定了关键的氨基酸残基，有利于人工模拟多肽的合成。卢慧丽［23］通过模拟天然配基结构，基于目标蛋白结构对多肽配基进行理性设计。利用组合化学技术，噬菌体展示技术，计算机辅助筛选技术对仿生配基的筛选。此方法可方便、简单、有效的筛选多肽类亲和配基。董晓燕等［24］在前人的基础上利用Fmoc固相合成法，从噬菌体展示肽库中筛选出了能与胰岛素特异性结合的七肽片段。Tong等［25］利用分子模拟方法研究了与IgG中Fc片段特异性结和的亲和配基，分析发现它们之间的结合主要为疏水性相互作用。随着人们对大分子亲和配基研究的不断深入，特别是对其机理的探索，有利于开发出更多新型廉价的多肽类配基。

2 小分子亲和配基

相对于大分子亲和配基，小分子亲和配基稳定性好、价格低廉、具有广泛的应用前景。常用的小分子类亲和配基包括染料类、氨基酸类配基等。

2.1 染料配基

染料配基与酶蛋白之间存在着特异性亲和作用，是一种理想的亲和配基。常用的染料配基为Cibacron Blue F3GA、Procion Red HE-3B、Procion Blue MX-R、Reactive Red 120 和 Reactive Brown 10。其中Cibacron Blue 3GA最常见，它含有氯化的三嗪活性官能团可以在碱性条件下与含羟基的物质发生亲和取代反应，从而固定在载体上分离蛋白。染料配基具有价格廉价、结构稳定、结合蛋白容量大、容易再生等优点。可用于分离纯化血清蛋白、血清脂蛋白、凝块因子、铁传递蛋白等血液中的蛋白，核酸酶、干扰素、磷酸二酯酶、溶菌酶、聚合酶、脱氢酶和糖解酶等蛋白。

尼龙膜具有较好的机械性能可作为染料配基的载体。Chen等［26］在尼龙膜上连接Reactive Red 120、Reactive Brown 10染料配基，对木瓜蛋白的吸附量分别为143.6 mg/g、107.3 mg/g。Nie 等［27，28］用甲醛活化尼龙膜，壳聚糖修饰，偶联Cibacron Blue F3GA，对木瓜蛋白的吸附能力达到235.3 mg/g。回收率达到94.3%，且不会使木瓜蛋白变性。对其吸附过程进行热力学分析，发现吸附为自发吸热反应。壳聚糖具有很好的生物相容性与丰富的官能团，对染料配基的固定能力更好。Li等［29］在改性后的磁性壳聚糖微球上连接了Reactive Red 120，提高了对溶菌酶的吸附能力。染料配基拥有良好的应用前景，但自身也存在着与目标蛋白特异性低，有一定的毒性等缺点。可通过应用生物信息学和分子模拟技术，人工设计出结合能力更高的生物模拟色素加以解决。

2.2 氨基酸类配基

氨基酸是含有氨基和羟基的一类化合物通称，也是组成蛋白质的基本单位。常用的氨基酸类配基包括组氨酸、精氨酸、色氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、丝氨酸。可用于内毒素去除与球蛋白的纯化。

白金山［30］以琼脂糖凝胶Sepharose CL-6B作为基质，分别利用环氧氯丙烷和1，4-丁二醇-二缩水甘油醚对其进行活化，得到不同间隔臂长度和活化密度的环氧基团，进一步进行精氨酸配基的固定化，研究了不同间隔臂长度和配基密度对质粒DNA动态吸附容量的影响。鞠佳［31］以醋酸纤维素/聚乙烯基亚胺共混亲和膜为基质，通过戊二醛活化引入间隔臂，固载具有一定特异性吸附的5种有机胺和8种氨基酸配基强化了血清胆红素的去除效果。徐堃［32］分别以L-天冬氨酸、L-精氨酸、L-丝氨酸作为亲和配基，以1，6-己二胺为间隔臂，连接到聚偏氟乙烯载体上，制备的亲和膜可用于去除人血浆中的内毒素。并将亲和膜对动物血浆中内毒素的去除进行了放大实验，取得了很好的效果。

3 金属类配基

3.1 金属配基的作用原理

固定化金属离子亲和层析是Porath等于1975年首次提出的一种亲和分离技术。由金属离子、载体、间隔臂三部分组成。它利用金属离子与暴露在目标蛋白表面的氨基酸残基如组氨酸的咪唑基、半胱氨酸的巯基和色氨酸的吲哚基相结合的原理达到特异性结合的目的。不同的金属离子与蛋白结合能力与其所带电荷、离子半径和电子层结构有关，半径越小与蛋白形成的配合物越稳定。固定金属离子的载体包括无机载体与有机载体，常见的无机载体为硅胶，有机载体为交联葡聚糖、交联葡聚糖、琼脂糖、大孔纤维素等。不同载体的物理、化学性质的差异会直接影响与组氨酸的结合效率。用间隔臂连接金属离子，可以减少空间位阻，并且有利于选择性的结合蛋白，常用的间隔臂包括齿状螯合剂亚氨基二乙酸、N-羟乙基乙二胺三乙酸与染料螯合剂Cibacron blue 3GA、Cibacron red 3BA。

3.2 金属离子配基的应用

组氨酸残基对固定在IDA载体上的Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的亲和力依次下降，如果目标蛋白中部含组氨酸或连接不同的间隔臂，就需要选择合适金属离子。李琼等［33］利用环氧氯丙烷活化琼脂糖凝胶，连接亚氨基二乙酸和羟甲基天冬氨酸间隔臂，螯合镍离子与钴离子，用于分离纯化六聚组氨酸融合蛋白，纯化效果优于商业化的Ni-NTA介质。制备的Sepharose-CL-6B-IDA-Ni2+可用于商业化中分离组氨酸标记的蛋白。另外亲和膜技术与金属配基的结合用有助于提高分离纯化目标蛋白效率。Ke等和Eldin［34，35］利用环氧氯丙烷活化纤维素膜，连接IDA间隔臂，螯合铜离子，分离纯化青霉素酰化酶发现，氢氧化钠浓度影响环氧氯丙烷活化效果，并确定了反应的最佳条件。同时研究了不同金属离子对D-海因酶酶活的影响发现，Mn2+、Co2+、Ni2+、Fe3+对D-海银酶酶活具有促进作用，Cu2+对酶活有抑制作用。可能是金属离子插入到D-海因酶

中，改变了酶的构造。载体上连接不同的金属离子纯化D-海因酶，所得蛋白量与酶活均不同，提出利用不同金属的协同作用分离纯化目标蛋白的方法。有时间隔臂的选择会影响金属配基的利用率，Wu等［36］在纤维素膜上连接了不同的螯合剂，齿状螯合剂亚氨基二乙酸、N-羟乙基乙二胺三乙酸与染料螯合剂Cibacron blue 3GA、Cibacron red 3BA，分别偶联Cu2+。比较了不同螯合剂的利用率及对蛋白质吸附能力的影响，发现染料类螯合剂利用率较低但对蛋白的吸附能力优于齿状螯合剂。它们对溶菌酶、BSA、γ-球蛋白的吸附能力逐渐减小，可能是由于分子大小及可利用组氨酸数目不同引起的。本课题组用环氧氯丙烷交联的壳聚糖聚乙烯醇连接IDA做间隔臂，螯合铜离子做亲和配基，研究这一系列膜对组氨酸标记蛋白丝氨酸羟甲基转移酶的分离纯化，效果良好。

图2 亲和膜分离蛋白机理

3.3 金属配基的优缺点

金属离子类配基具有价格低廉，结构稳定，可再生等优点在蛋白质纯化分离中已成为最有效的亲和配基之一。但也存在着不足，如洗脱过程中会伴随着金属离子的问题，影响了目标蛋白的纯度及安全。目前可以通过选择合适的洗脱液，或者在纯化过程中增加吸附金属离子的环节解决。

4 展望

随着蛋白质分离技术的发展，寻找合适的配基成为分离的关键。传统的生物大分子类配基特异性高但价格昂贵，小分子类、金属类配基成为目前发展最快，应用最广泛的亲和材料。随着对亲和配基识别机理的深入研究，制备性能更优的配基成为了可能［37］。近年来反义肽的组合化学与分子模拟技术的发展为配基的筛选与设计提供了新的思路。分子印迹也为人工合成亲和配体提供了新方法。另外亲和载体的开发与制备，有利于高效的利用亲和配基，提高纯化效率。特别是亲和膜技术的发展有利于其工业化的应用。

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（责任编辑 李楠）

The Progress of Affinity Ligand in Affinity Separation Technology

ZENG Rong1JIN Bu-Kun2RUAN Tao2WU You2HOU Ya-Li2GONG Zhi-Wei2YANG Zhong-Hua2
（1. College of Chemistry and Chemical Engineering，Hubei University，Wuhan 430062；2. College of Chemical Engineering and Technology，Wuhan University of Science and Technology，Wuhan 430062）

Affinity separation technology plays an increasingly important role in the proteins separation and purification field. Development of an appropriate ligand is the critical factor for affinity separation technology. In this work，the current research progress of the affinity ligand is reviewed according to three categories i.e. biological macromolecules affinity ligands，small molecule affinity ligands and metal iron affinity ligand. The current progress of each kind of ligand，its action mechanism and its deficiency are highlighted. Also，the prospect for development of affinity ligands is also given.

Specific adsorption；affinity；purification；chromatography；ligand

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016.12.008

2016-03-18

国家自然科学基金项目（21376184）

曾嵘，女，讲师，研究方向：膜分离技术；E-mail：rongZengco@163.com；靳步昆同为本文第一作者

杨忠华，男，教授，研究方向：生物催化与转化；E-mail：yangzh@wust.edu.cn