典型抗生素与群体感应抑制剂对费氏弧菌的三元慢性联合毒性

方章顺，姚志峰，王婷，林志芬，左胜鹏,*

1. 安徽师范大学环境科学与工程学院，芜湖 241002 2. 同济大学环境科学与工程学院，上海 200092



典型抗生素与群体感应抑制剂对费氏弧菌的三元慢性联合毒性

方章顺1，姚志峰2，王婷2，林志芬2，左胜鹏1,*

1. 安徽师范大学环境科学与工程学院，芜湖 241002 2. 同济大学环境科学与工程学院，上海 200092

群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor, QSIs)广泛应用之后与环境中现有抗菌药物共存的趋势不可避免。为了评价QSIs和现有抗菌药物共存所引起的生态环境效应，本文以费氏弧菌(Vibrio fischeri)作为模式生物，磺胺类抗生素磺胺氯哒嗪(SCP)、磺胺类增效剂甲氧苄嘧啶(TMP)和群体感应抑制剂4-溴-5-溴亚甲基-2(5氢)-呋喃酮(FC-30)为研究对象，测定了以上3个化合物对Vibrio fischeri的单一/混合慢性毒性效应。单一慢性毒性结果表明，3个化合物的毒性大小如下：FC-30

抗生素；群体感应抑制剂；费氏弧菌；三元混合；慢性毒性；联合毒性

Received 2 November 2015 accepted 30 November 2015

抗生素自发现以来，因其对病原微生物的特异性，进而无节制大量使用[1]。随着抗生素使用量的逐渐增加，全球每年仅兽用抗生素的消费总量就达到100 000～200 000 t[2-3]。Thomas等[4]研究了全球抗生素用量的变化，结果显示近十年来抗生素用量增加了36%，其中以中国为主的5个国家抗生素用量占增加的76%。抗生素滥用造成的抗性基因问题引起了广泛关注[1-5]，寻找抗生素替代品是目前解决抗性基因的重要途径。群体感应抑制剂(quorum sensing inhibitor, QSI)是目前提出较为理想的抗生素替代品。可干扰细菌的群体感应，进而抑制细菌的生长。QSI与抗生素的联合使用使得细菌对后者的敏感心增加，因此研究者可以尝试用低剂量的抗生素和QSI联合用药，这可能会起到更好的效果。另外，如果QSI在未来大量使用，那它与抗生素在环境中共存的可能性极大，因此对QSI与抗生素联合毒性进行研究是必要的，可为生态风险评价提供借鉴意义。

磺胺类抗生素(sulfonamides, SAs)在1937年被发现，因其对细菌具有广谱抗菌性、疗效高、廉价等优点成为最早系统性药用的抗生素之一。磺胺类抗生素不易降解，属于新型的POPs[6]。在选用抗菌药物时，为了达到更好的疗效，降低治疗过程会产生的副作用，临床医生常常采用联合用药的方式。TMP是磺胺类抗生素常用的增效剂，临床上常常联合使用，因此二者在环境中联合存在的可能性较高。呋喃酮类化合物是研究最早的QSI，被证实具有良好的群体感应效应的拮抗作用，能有效抑制生物膜的形成，有良好的抑菌效果[7]，未来被临床上应用的可能性较大，一旦其进入环境中，必定与现有的SAs和TMP联合存在。所以三者联合毒性研究具有重要的现实意义。

本课题组前期对SAs和TMP的联合毒性，以及SAs和QSI的联合毒性进行了初步研究[8-14]，研究发现SAs和TMP的急性联合效应为协同，慢性联合效应为拮抗，并指出急慢性毒性过程中作用蛋白不同是导致联合效应不同的根本原因。同时发现大部分呋喃酮类化合物与磺胺类抗生素的急性联合毒性为协同作用。三元慢性毒性还未涉及，那么，QSI与抗生素的慢性联合效应如何；在评价联合毒性时，对环境的影响如何？这是本研究所关注和所要回答的问题。

费氏弧菌(Vibrio fischeri)作为典型的革兰氏阴性菌，特别是作为抗生素及QSI的靶生物，在联合毒性效应研究中已被广泛应用[15-16]。本研究以Vibrio fischeri作为模式生物，以环境中常被检测出的SCP、TMP及FC-30作为研究对象，测定了3种药物对Vibrio fischeri的单一慢性毒性和三元混合慢性毒性，并回答联合效应的原因，为环境生态风险评价提供科学依据。

1 材料与方法 (Materials and methods)

1.1 试剂与仪器

实验使用化合物均购自Sigma-Aldrich化学制品有限公司(St. Louis, MO, USA)，具体试剂信息如表1所示。进行慢性毒性测试所用化合物配制使用助溶剂二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO)，DMSO浓度均控制为1‰。

所用仪器及软件：化学发光分析仪(BH9507，北京滨松光子技术股份有限公司)、高压蒸汽灭菌锅、精密电子天平(BT25，德国saryorius公司)、电子pH计(PH510，美国OAKTON公司)、超净工作台、全自动新型生化培养箱(ZSD-1430，上海智城分析仪器有限公司)、恒温培养振荡器、超声波清洗器和恒温鼓风干燥箱等。

表1 实验用化合物名称及结构

1.2 Vibrio fischeri慢性毒性测定

1.2.1 菌种及培养及配制

Vibrio fischeri冻干粉购自中国科学院南京土壤研究所。培养基选择参照供应商提供的配方配制。菌液配制：在超净工作台中，取适量斜面三代菌种接入5 mL液体培养基，在22 ℃恒温条件下培养至对数生长期(12～16 h)成为药瓶菌液。取处于对数生长期的摇瓶菌液约0.2 mL，加入到20 mL的3%NaCl溶液中，磁力搅拌40 min后，此时菌液的发光强度平稳，即可将菌液用于毒性测定。

1.2.2 毒性试验

本论文基于Microtox急性毒性测试原理[17]与水质急性毒性测定发光[18]细菌法进行毒性测试。在每一测试管中加入800 μL测试溶液(含预设浓度梯度待测化合物，不足800 μL部分使用2% NaCl溶液补齐)，振荡1 min混匀。在上述测试溶液中加入200 μL工作菌液，统一振荡1 min混匀。将加菌溶液于22 ℃恒温条件下培养24 h，使用化学发光免疫分析仪(BHP9507)测定发光值。

1.2.3 毒性测试数据表征

化合物毒性用其对Vibrio fischeri的发光抑制率表述[19]，如式(1)所示：

其中，S表示测试样的发光值，C表示空白平均发光值。

慢性联合毒性采用指标(TU)来表征，其计算方法如式(2)所示：

TU=CA/EC50A+CB/EC50B

其中，CA和CB是混合体系半数抑制效应时单一污染物(A、B)在混合体系中的摩尔浓度(mol·L-1)；EC50A和EC50B分别是污染物单一污染时的半数效应浓度。

根据Broderius[20]的研究，当0.8TU1.2，认为两组分间存在加和效应；当TU1.2表明组分间存在拮抗效应；当TU0.8意味着组分间存在协同效应。

2 结果与讨论(Results and discussion)

2.1 SCP、TMP和FC-30对Vibrio fischeri的单一慢性毒性

测定了SCP、TMP和FC-30对Vibrio fischeri的单一慢性毒性，结果如图1所示。

图1 SCP、TMP和FC-30对Vibrio fischeri单一慢性毒性Fig. 1 The single toxicity of SCP, TMP and FC-30 to Vibrio fischeri

图2 SCP、TMP和FC-30等毒性比组成的三元混合物慢性联合毒性Fig. 2 The tertiary mixture toxicity of SCP, TMP and FC-30 at equal toxic ratio

从图1中可以看出，3种化合物对Vibrio fischeri单一慢性毒性均呈现hormesis效应，即低剂量促进高剂量抑制的双向剂量效应关系。

此外，3种化合物的慢性毒性大小顺序如下所示：FC-30(EC50=2.44×10-5mol·L-1)< SCP(EC50=7.78×10-6mol·L-1)

图3 等毒性比组成的二元混合物慢性联合毒性Fig. 3 The chronic mixture toxicity of binary mixture at equal toxic ratio

2.2 SCP、TMP和FC-30对Vibrio fischeri的三元联合毒性作用

根据Lin等[21]提出的顶点假设理论可知，当化合物各组分以等毒性比(1:1:1)混合时，联合效应最强。因此本文根据单一化合物的慢性毒性结果，在等毒性比的情况下，测定了SCP、TMP和FC-30三元混合物对Vibrio fischeri的慢性混合毒性，结果如图2所示

从图2可以看出，与单一毒性结果相似，三元混合物的慢性毒性也呈现hormesis效应。此外，根据公式(2)计算了混合体系的联合效应，结果显示TU为2.3，说明了三元混合物的联合毒性效应为拮抗作用。

前期研究表明SAs和TMP的二元慢性联合效应为协同，而本文研究表明SCP、TMP和FC-30的三元混合物的联合效应为拮抗，那么三元混合物产生拮抗作用的原因是什么呢?

2.3 SCP、TMP和FC-30对Vibrio fischeri的二元联合毒性作用

为了回答以上问题，以SCP、TMP和FC-30在三元混合体系中的浓度(CSCP=2.93×10-5mol·L-1，CTMP=3.72×10-6mol·L-1，CFC-30=9.76×10-5mol·L-1)为基础，分别建立了相应的二元混合体系，即SCP+TMP，SCP+FC-30和TMP+FC-30，并测定了二元混合体系对Vibrio fischeri的慢性毒性，结果如图3所示。

由图3(a)可知，SCP和TMP在毒性比为1:1时，TU值为0.2，说明二者联合呈现协同作用。而图3(b, c)中，在毒性比1:1时，SCP+FC-30和TMP+FC-30两个混合体系的最大抑制率未超过6%，这说明二者混合暴露的毒性小于单一化合物暴露毒性相加，即FC-30与SCP和FC-30与TMP的两个混合体系的相互作用皆为拮抗。可见FC-30与SCP或TMP之间的拮抗作用是导致3种化合物联合用药时联合效应为拮抗作用的根本原因。

那么，在联合毒性评价中，应该考虑到在慢性毒性条件下，QSI和磺胺类抗生素联合用药时可能产生拮抗作用。

综上可知：

(1)本文测定了SCP、TMP以及FC-30对Vibrio fischeri的单一慢性毒性，结果表明SCP、TMP和FC-30对Vibrio fischeri单一慢性毒性均呈现hormesis效应，毒性大小顺序如下TMP>SCP>FC30。

(2)测定了SCP、TMP和FC-30对Vibrio fischeri的三元联合慢性毒性，结果表明联合效应为拮抗。并指出FC-30和SCP以及FC-30和TMP二元混合体系的拮抗作用导致了三元混合体系联合作用为拮抗。

(3)在毒性评价中，FC-30与SCP或TMP联合时具有拮抗作用，对环境的影响小。

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◆

Chronic Joint Toxicity of Sulfa Antibiotics and Quorum Sensing Inhibitors toVibriofischeri

Fang Zhangshun1, Yao Zhifeng2, Wang Ting2, Lin Zhifen2, Zuo Shengpeng1,*

1. College of Environmental Science and Engineering, Anhui Normal University, Wuhu 241002, China 2. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

Being promising antibiotic alternatives, quorum sensing inhibitors (QSIs) will unavoidably coexist with the existing antibiotic drugs after its wide application. To assess the joint toxicity of QSIs and existing antibiotic chemicals, sulfachloropyridazine (SCP), its synergist-trimethoprim (TMP) and furanone C-30 (FC30), a kind of QSIs) were selected as objects, and we determined their single/mixture chronic toxicity on Vibrio fischeri. The results showed that the order of single chronic toxicity was FC30 < SCP

antibiotics; quorum sensing inhibitors; Vibrio fischeri; tertiary mixture; chronic toxicity; joint toxicity

10.7524/AJE.1673-5897.20151102001

污染控制与资源化研究国家重点实验室自主课题资助(PCRRK16007)；中国国家自然科学基金(201177092，21377096，21577105)；同济大学“攀登”计划(0400219287)；111项目，上海市科技委员会(14DZ2261100)资助；安徽师范大学2015度研究生科研创新与实践项目

方章顺(1991-)，男，硕士，研究方向为微生物毒理学，E-mail: 15801769917@163.com；

*通讯作者(Corresponding author)， E-mail: whmzsp79@ahnu.edu.cn

2015-11-02 录用日期：2015-11-30

1673-5897(2016)2-369-05

X171.5

A

简介：左胜鹏(1979— )男，博士，教授，硕士生导师，主要从事环境生态学、入侵生态学、农业生态学等研究。

方章顺, 姚志峰, 王婷, 等. 典型抗生素与群体感应抑制剂对费氏弧菌的三元慢性联合毒性[J]. 生态毒理学报，2016, 11(2): 369-373

Fang Z S, Yao Z F, Wang T, et al. Chronic joint toxicity of sulfa antibiotics and quorum sensing inhibitors to Vibrio fischeri [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2016, 11(2): 369-373 (in Chinese)