广西烟草立枯病菌和靶斑病菌菌丝融合群初步分析

陈媛媛，谭海文，卢燕回，黎起秦，林 纬，袁高庆

（1.广西大学农学院，广西 南宁 530005；2.田阳县农业局，广西 田阳 533600；3.中国烟草总公司广西壮族自治区公司，广西 南宁 530022）

广西烟草立枯病菌和靶斑病菌菌丝融合群初步分析

陈媛媛1，谭海文2，卢燕回3，黎起秦1，林 纬1，袁高庆1

（1.广西大学农学院，广西 南宁 530005；2.田阳县农业局，广西 田阳 533600；3.中国烟草总公司广西壮族自治区公司，广西 南宁 530022）

为了明确广西烟草立枯病菌和靶斑病菌的菌丝融合群，从广西发病烟草植株上分离了2株烟草立枯病菌菌株和3株靶斑病菌菌株。经形态特征和细胞核染色观察发现，这5株菌株均属于多核立枯丝核菌。依据供试菌株与标准菌株的菌丝融合反应，发现广西烟草立枯病菌和靶斑病菌均包含AG-2和AG-4两个菌丝融合群。进一步分析5个菌株的rDNA-ITS序列，初步明确这2种病原菌包括AG-4 HG-I和AG-2-2 IIIB 两个菌丝融合群，与菌丝融合反应分析结果相吻合。首次在国内从烟草靶斑病组织上分离到AG-2 和AG-4 融合群。

烟草立枯病；烟草靶斑病；立枯丝核菌；菌丝融合群

1 材料与方法

1.1 病原菌的分离和纯化

采用水琼脂法［9］分离立枯丝核菌。即将疑似烟草立枯病的病茎或靶斑病的病叶冲洗干净，保湿1 d，挑取病斑处的菌丝移入水琼脂（WA）平板上，28℃培养2 d后进行单菌丝切割，移植于马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）平板上培养，最后将获得的纯培养物保存于PDA斜面试管中。

1.2 病原菌的培养性状和形态特征观察

根据 Parmeter等［10］的鉴定标准，镜检初步确认是立枯丝核菌后，观察病原菌的培养性状。病原菌细胞核的测定参照黄江华等［11］的方法，将供试菌株移入PDA 平板上，在培养基上斜插入灭菌盖玻片，28℃下培养，待菌丝长至盖玻片的1/2 处左右时，取出盖玻片，滴上番红O-KOH染色液染色3 min，光学显微镜下镜检细胞核数目。

1.3 立枯丝核菌的菌丝融合试验

菌丝融合群标准菌株AG-1-IA、AG-2-2 IIIB、AG-2-2 IV、AG-2-I、AG-4、AG-9、AGBI，由广西农业科学院微生物研究所惠赠。采用玻片对峙培养法，将获得的立枯丝核菌株分别与菌丝融合群标准菌株进行配对培养12～24 h，镜检菌丝的融合情况，初步判别各待测菌株的菌丝融合群［12］。

1.4 病原菌的rDNA-ITS序列测定

将烟草立枯病菌菌株以及靶斑病菌菌株置于马铃薯葡萄糖（PD）培养液中28℃、黑暗条件下静置培养2 d，收集菌丝真空干燥，采用SDS法提取菌体DNA［13］。采用真菌核糖体基因内源转录间隔区的通用引物 ITS4和 ITS5对5个供试菌株的 rDNA-ITS 序列进行PCR扩增。50 μL反应体系中含有：10×PCR缓冲液（含Mg2+） 5.0 μL，DNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，dNTP（2 mmol/L） 5.0 μL，引物ITS4和ITS5各 4.0 μL（5 μmol/L），Taq DNA聚合酶（5 U/μL）0.5 μL，ddH2O 30.5 μL。反应在Biometra TProfessional PCR仪上进行，扩增反应程序为：94℃ 预变性 3 min; 94℃ 变性 40 s，55℃复性1 min，72℃ 延伸 1 min，进行35 个循环；72℃ 延伸 10 min。反应完成后，取5μL扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，通过UVI FireReader 1D凝胶成相系统观察结果，并对PCR产物送检测序。将所得测序结果在GenBank核酸序列数据库中进行比对分析，查找同源性最高的序列，并下载已有文献报道过的相关菌株的rDNA-ITS序列，采用软件Clustal X和MEGA 4进行系统发育分析。

2 结果与分析

2.1 病原菌的培养性状和形态特征

从广西罗城和德保获得2个烟草立枯病菌菌株，从罗城和钟山获得3个靶斑病菌菌株。在28℃下培养，各供试菌株在PDA 的菌丝特征均表现为：菌丝分枝呈锐角至直角，分枝处缢缩明显，分枝附近有一个隔膜，后期部分菌丝细胞

膨大呈椭圆体至筒状，每个细胞有3～14个细胞核，符合立枯丝核菌的形态特征。培养3～4 d后，各菌株均可形成初期白色粉状后期变褐的菌核。28℃培养14 d后，各供试菌株特征见表1和图1（封二）。根据5个供试菌株的培养性状，初步将菌株LC11-6和 LC11-10归为一类，菌株DB11-1、 LC11-11和 ZS11-7归为一类，不同类群菌株之间的培养性状有明显差别。烟草立枯病菌和烟草靶斑病菌均分别包含有这2类菌株。同一来源地的菌株，如LC11-6 、LC11-10和 LC11-11均来自罗城，包含有2个类群；而不同来源地的菌株从培养性状上亦可归为一类，如LC11-11和ZS11-7分别采自罗城和钟山，属于同一个类群。

表1 广西烟草立枯病菌菌株和靶斑病菌菌株的培养性状比较

2.2 立枯丝核菌的菌丝融合反应

通过将供试菌株与各融合群标准菌株进行配对培养观察，初步将菌株LC11-6、LC11-10划分至AG-4融合群，菌株DB11-1、LC11-11、ZS11-7归为AG-2融合群，与通过培养性状划分的类群结果相符合（图2，封二）。

2.3 病原菌的rDNA-ITS序列测定

菌株LC11-6、DB11-1、LC11-10、LC11-11和ZS11-7的rDNA -ITS序列的PCR产物大小分别为483、513、508、497、683 bp，在GenBank中的登录号分别为JN983494、JN983497、JN983495、JN983496和JN983498。通过序列同源性比对，这5个供试菌株获得的rDNA -ITS序列与立枯丝核菌或其有性世代瓜亡革菌（T. cucumeris）的同源性达97%～100%。

使用软件Clustal X对各供试菌株序列与从GenBank下载的17个相关序列进行比对，以R. cerealis作外群，采用软件MEGA 4构建了系统发育树（图3）。菌株LC11-6和LC11-10的同源性达99%，以57%的支持率处于一个小分枝，并以98%的支持率与归为R. solani AG-4 HG-I的2个菌株（AY270004、FM867595）处在一起；菌株ZS11-7、LC11-11和 DB11-1以82%的支持率与归属为R. solani AG-2-2 IIIB 的2个菌株（AB054857、AN054854）聚在一起，其中同源性高达100%的2个菌株LC11-11和ZS11-7以94%的支持率聚在一个小分枝上，两者与同源性均为99%的菌株DB11-1以92%的支持率聚在一起。

rDNA-ITS序列分析结果显示，5个供试菌株均为R. solani，其中菌株LC11-6和LC11-10为R. solani AG-4 HG-I，菌株DB11-1、LC11-11和 ZS11-7为R. solani AG-2-2 IIIB。通过rDNAITS序列鉴定的R. solani菌丝融合群结果和依据玻片对峙培养法分析的结果一致。

图3 R. solani及其近缘种基于rDNA-ITS序列的分子系统发育树

3 结论与讨论

本研究结合病原菌的培养性状、形态特征、ITS序列同源性比较以及系统发育树分析的结果，将引起广西烟草立枯病、靶斑病的病原菌鉴定为有丝分裂孢子真菌（mitosporic fungi）丝核菌属（Rhizoctonia）立枯丝核菌（R. solani）。其中引起烟草立枯病的菌株LC11-6 和DB11-1分别属于R. solani AG-4 HG-I和AG-2-2 IIIB；引起烟草靶斑病的菌株ZS11-7和LC11-11均属于R. solani AG-2-2 IIIB，而另一个菌株LC11-10为R. solani AG-4 HG-I。

立枯丝核菌为土壤习居菌，不产生任何无性孢子，分布广泛，可引起多种作物病害。R. solani作为一个复合种，不同菌株间在形态学、生理生化、病理学等方面存在较大差异。1937年，Schultz首次提出以菌丝融合为基础来确定菌丝融合群，至今已报道立枯丝核菌有14个菌丝融合群（从AG- 1 到 AG-13、AG- BI）［14］。菌丝融合群能在一定程度上反映立枯丝核菌菌株间的亲缘关系及其遗传多态性，与该病菌的致病性及与寄主之间的互作紧密相关。目前菌丝融合分类法已成为研究R. solani遗传多态性的通用分类方法。研究丝核菌菌丝融合群的传统方法是玻片对峙培养法，随着现代分子生物学学科的发展，人们发现R. solani不同融合群菌株间的rDNA-ITS区域序列存在很大变异性，采用该方法分析可以更简单、快速、准 确地获知菌丝融合群信息［15］。本研究同时采用玻片对峙培养法和rDNA-ITS序列分析法，获得的立枯丝核菌菌丝融合群结果相一致。

国外已有较多关于烟草上立枯丝核菌融合群的研究报道。Nicoletti等［16］在1999年将意大利及法国受害烟株上分离的立枯丝核菌分别归属为AG-1、AG-3、AG-4及AG-5融合群，另有部分菌株与AG-2-1的亲缘关系最

近；Gurkanli等［17］报道该菌属于AG-1-IB、AG-2-1、AG-4 HG-I、AG-4 HG-II 4个融合群；希腊主产烟区的立枯丝核菌的菌丝融合群也很丰富，包括AG-2-1、AG-4 HG-I、AG-4 HG-III及AG-5等4个融合群［18］；LaMondia 等［4］报道引起美国马萨诸塞州烟草靶斑病的R. solani融合群为AG-3；Seema 等［14］在2006—2008年从印度卡纳塔克邦烟苗茎基部分离获得27个立枯病菌菌株，经鉴定全部属于AG-4 HG-I；Gonazlez等［19］认为AG-2-2和AG-4主要引起烟草茎部病害，而AG-3主要引起烟草靶斑病；但据Guadalupe等［20］对阿根廷西北地区烟草上的立枯丝核菌研究结果，AG 4 HG-I 和 AG 4 HG-III 主要引起烟草立枯病，AG 2-1既可导致立枯病也可引起靶斑病。与国外相比，国内有关为害烟草的立枯丝核菌的研究较少。吴元华［21-22］、Zhao等［23］报道我国辽宁地区的烟草靶斑病菌属于AG-3融合群；苏燕妮等［7］分析认为我国吉林省和黑龙江省的烟草靶斑病菌也属于AG-3融合群。除了多核丝核菌引起烟草病害外，在希腊、土耳其和阿根廷还发现双核丝核菌（binucleate Rhizoctonia ，BNR）可以引起烟草根腐病［18，20，24］。以上研究结果反映出为害烟草的丝核菌种群的多样性。

本研究中广西的3个烟草靶斑病菌菌株均不属于AG-3融合群，却包括AG-2-2 IIIB和AG-4 HG-I两个融合群，这与已知的国内报道结果不相同；目前有关AG-4可引起烟草叶片田间自然发病的现象仅出现在美国卡罗莱纳州北部，据报道当地1984—1989年发生的烟草靶斑病由少量AG-4 菌株引起［25］。本研究中另外两个广西烟草立枯病菌菌株分属于AG-2-2 IIIB和AG-4 HG-I这两个融合群，与Gonazlez等［19］对烟草立枯病菌的研究结果一致。引起不同烟区烟草病害的R. solani隶属于不同菌丝融合群或亚群的原因可能与地点、环境、烟草品种、侵染部位等多种因素有关，但具体原因有待探讨。本研究结果也在一定程度上显示出广西烟草上立枯丝核菌菌丝融合群的多样性和独特性，值得进一步深入研究。

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（责任编辑 杨贤智）

Anastomosis groups of Rhizoctonia solani causing tobacco sore shin and target spot in Guangxi

CHEN Yuan-yuan1，TAN Hai-wen2，LU Yan-hui3，LI Qi-qin1，LIN Wei1，YUAN Gao-qing1
（1. College of Agriculture，Guangxi University，Nanning 530005，China；2. Tianyang Agriculture Bureau，Tianyang 533600，China；3. Guangxi Zhuang Autonomous Region Tobacco Company of CNTC，Nanning 530022，China）

In order to investigate the anastomosis groups of the pathogens causing tobacco sore shin and target spot in Guangxi，two strains were isolated from diseased basal stems and three strains were isolated from diseased leaves. Based on morphological characteristics and nuclear staining，five strains were identified as Rhizoctonia solani and they all belonged to multinucleate. Through hyphal anastomosis reactions between tested strains and standard strains，the pathogens of tobacco sore shin and target spot in Guangxi were all divided into two anastomotic groups: AG-2 and AG-4. Moreover，ITS sequences analysis of the five strains indicated that the two anastomosis groups were AG-4 HG-I and AG-2-2 IIIB，and it was in accord with the result of hyphal anastomosis reaction. AG-2 and AG-4 were firstly found in tobacco leaf in China．

tobacco sore shin；tobacco target spot；Rhizoctonia solani；anastomosis groups

S435.72

A

1004-874X（2016）10-0106-06

2016-07-20

中国烟草总公司广西壮族自治区公司科技创新项目（2014-07）

陈媛媛（1990-），女，在读硕士生，E-mail：724919508 @qq.com

袁高庆（1971-），女，博士，副教授，E-mail：ygqtdc@sina.com

陈媛媛，谭海文，卢燕回，等. 广西烟草立枯病菌和靶斑病菌菌丝融合群初步分析［J］.广东农业科学，2016，43（10）：106-111.

烟草立枯病由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani K ü hn）引起，于1904年由美国首次报道，目前在所有产烟国家均有分布，同时也是我国烟区的常见病害之一。在我国以往的报道中，

烟草立枯病主要属于苗床期病害［1］，但近年来该病逐渐演变为大田期病害，在我国福建、广西等地都有发生且有为害加重的趋势［2-3］。立枯丝核菌除为害烟株茎基部外，还可以为害烟叶，称之为靶斑病。烟草靶斑病首次于1948年在巴西布雷尔烤烟上发现，1989年曾在美国北卡罗来纳州流行，目前主要分布于美国、巴西、意大利、津巴布韦、南非等烟区［4］。吴元华等于2006年在我国辽宁丹东首次发现并报道烟草靶斑病［5］，之后该病在辽宁多个烟区普遍发生，局部田块为害严重；2013年，在吉林省和黑龙江省的烟草种植区也发现该病，且发病面积广造成损失重［6-7］；广西最先是在2011年发现烟草靶斑病的为害，虽然发病仅局限于若干个烟区，但个别田块发病率达到27%［8］。然而广西烟草靶斑病的田间症状与吴元华等［5］报道的有所不同，表现在病斑无轮纹，虽然病斑坏死组织会破碎，但形状并不似靶斑，病斑处也未发现立枯丝核菌的有性世代等［8］。烟草立枯病和靶斑病是广西烟草大田期新出现的病害，很有必要对这两种病害的病原菌进行鉴定，并探讨其菌丝融合群分化状况，以期为深入研究病原菌种群遗传变异规律及抗病育种奠定基础。