一种新的生物组织质谱成像方法及仪器集成

胡勇军, 陈家新, 陆 桥

(华南师范大学生物光子学研究院，广州 510006)



一种新的生物组织质谱成像方法及仪器集成

胡勇军*, 陈家新, 陆 桥

(华南师范大学生物光子学研究院，广州 510006)

介绍了一种免标记质谱分子成像新技术，即红外激光解析/真空紫外激光后电离质谱成像方法. 该方法具有样品前处理简单，无需人为添加基质等优点. 同时，这种成像方法还可以通过在时间和空间上独立优化2束激光的波长、强度以及延迟时间来获得最佳的质谱成像探测条件. 首次应用该实验技术成功地探测抗癌药物吖啶黄素在小鼠肾脏组织切片中的空间分布，其空间分辨率低于100 μm，单一成像点检测灵敏度可达0.1 pmol. 这种新型的质谱成像技术在临床医学和药物开发领域具有很好的应用前景.

吖啶黄素； 激光解析电离； 组织成像； 临床诊断

质谱成像是一种新型的原位成像技术，近年来，此技术因其能提供高度精确的分子分布信息而在诸多领域受到越来越广泛的关注. 质谱成像具有高灵敏度、高效率以及能够在复杂的生物体系中同时进行检测和鉴别多种分子等优点，不管是从细胞，还是组织，再到整个活体动物成像，质谱成像技术都可以很好地呈现出被观察对象的空间分布情况[1-2]. 这种原位分析技术的原理是利用激光或者离子束使切片表面的分子离子化，然后通过质谱测定这种离子化分子的质荷比(m/z)，再由软件重构出分析物在组织中分布的图谱[3]. 常见的质谱成像技术有matrix assisted laser desorption ionization (MALDI) 成像，电喷雾电离成像等质谱成像技术，但是，这些质谱成像技术有着自身的局限性，对于MALDI质谱成像技术来说，研究生物大分子有很好的效果，但是对于生物小分子来说，就显得不是非常方便，尤其是在特定的生物组织这个体系中，这种研究更加的困难. 此外，这种成像技术需要一种合适的基质，这些基质在实验的过程中也会对质谱信号产生一定的影响. 对于电喷雾电离质谱成像技术来说，每一个电喷雾的变量(如真空度、电势、溶剂的挥发性、溶液的导电性及电解质的浓度)都有可能对成像的结果产生很大的影响,此外，即使在良好的条件下，实验过程中也存在离子信号的波动[4-5]. 基于这个前提，本文介绍了一种由本研究组提出的质谱分子成像新技术，即红外激光解析/真空紫外激光后电离质谱成像方法. 与其他传统的质谱成像方法相比，该成像方法具有样品前处理简单、无需人为添加基质等优点. 这在某种程度上可以提高实验的效率以及准确性，同时，这种成像方法还可以在时间和空间上独立优化两束激光的波长、强度以及延迟时间来获得最佳的质谱成像探测条件.

本文系统介绍了红外激光解析/真空紫外光电离的实验原理、实验室质谱成像的仪器集成、实验室仪器成像的可行性验证、小鼠肾脏组织切片的制备以及组织成像，并对今后该质谱成像技术在临床医学以及药物研发领域的发展进行了展望.

1 实验原理及仪器

红外激光解析/真空紫外光电离飞行时间质谱仪的原理如图1所示，在红外激光解析/真空紫外激光系统中，解析激光和电离激光在时间和空间上相互独立，第一束激光一般采用光子能量较小的红外激光[6-7]，当解析激光照射到承载有样品的基体上时，被吸收的光在瞬间大部分转换成热能，并传递给待测样品，使其瞬间气化/解析[8]. 研究表明，短脉冲激光可以在10 ns时间内上升到108K的高温[9]，如此快的升温速度，可以避免分子因均匀受热而发生裂解，在解析光的照射下，在离靶体表面很近的范围内会形成一个体积约为1 mm3的气团，包含在该气团中的大部分为中性离子，其中中性离子所占的比例大约是带电离子的1 000倍以上[10]. 经过一定时间的延迟后，第二束电离激光被聚焦并引入到该气团，优化两者之间的延迟时间，这样可以极大地提高电离效率，有助于质谱信号的形成，被电离的离子随后被引入质谱仪中进行检测，第二束激光一般采用真空紫外光，光子的能量大概在10.48 eV，这是一种软电离技术，可以有效避免碎片的大量产生[11-12].

图1 激光解析后电离原理示意图

Figure 1 The schematic diagram of the principle of laser desorption photoionization

实验室自主搭建用来进行生物组织质谱成像的仪器示意图分别如图2、图3所示，该仪器主要由1个含有多个接口的高真空腔、2台固体激光器、1个电控三维进样平台、1个气体池、1个电脑操控程序以及1个线性的飞行时间质谱仪组成[13].

图2 激光解析后电离飞行时间质谱仪示意图

Figure 2 The schematic diagram of laser desorption postionization mass spectrometry (LDPI-MS)

图3 实验室成像仪器原理示意图

2台固体激光器(图2)中一台是YAG固体激光器泵浦产生的118 nm 真空紫外激光光源. YAG激光器的工作原理是活性的介质3价铷离子受到Xe灯辐射的激发,产生基频为1 064 nm的激光，该基频激光经过3倍频得到355 nm的激光，经聚焦射入成分比例为1∶10的Xe/Ar气体池, 产生的118 nm真空紫外光作为电离激光光源. 另外一台是国产的光泵浦固体激光器，可输出1 064 nm的激光作为解析激光. 这2台激光器的工作频率为10 Hz,通过一台DG535时间延迟器控制其与记录设备同步和采集.

三维进样平台如图2所示，是一个与质谱真空系统兼容的三维传动杆实验装置，三维平台的末端固定一个样品承载平台，接口处有一个手动的闸板阀将其与外界隔绝开来，在初级的真空接口上通过2个O型的橡胶圈密封，当进样杆装置缓缓插入真空系统中时，橡胶圈便通过密封进样杆将电离室与大气隔绝. 通过一个前级机械泵对其进行前期的抽取，抽取15 min后关闭前级机械泵. 打开手动的闸板阀,将涂布有样品的承载平台送入真空腔中的电离区[13]. 进样杆在三维平台的带动下运动，进而可以检测到药物分子在不同空间位置的信号强度，最后在成像软件的处理下，获得药物分子成像图. 图4是实验室三维平台进样系统示意图.

图4 三维平台进样系统示意图

2 实验过程

2.1 实验样品

本实验选择吖啶类药物中的吖啶黄素作为实验的测试样品，吖啶黄素作为一种吖啶类有机药物，早期作为处理含有性因子F的大肠杆菌和用于诱变酵母菌产生小菌落的药物，作用十分有限. 近年来，吖啶黄素其他用途也逐渐被人们发现，研究表明，吖啶黄素对于某些特殊的肿瘤具有抑制作用，这使人们对吖啶黄素的抗癌研究更加深入[14-15]，本实验采用一种新型的生物组织质谱成像法，对该抗肿瘤药物进行检测和研究.

2.2 实验仪器成像能力的测试实验

在进行动物组织成像实验之前，先对这套实验仪器成像的可行性进行初步的测试实验. 用亚甲基蓝(m/z为320)染料在承载基底(刚玉棒)上描绘出英文字母“SCNU”,即华南师范大学英文名字的首字母缩写(South China Normal University). 然后送入质谱成像系统中进行成像(图5). 下图为实物图,上图为质谱成像图. 结果表明：应用所搭建的质谱成像系统完全可以开展分子成像相关的实验.

图5 “SCNU”的质谱成像图以及实物图

Figure 5 The LDPI-MS image of “SCNU” and the corresponding digital photo

2.3 组织切片制备及组织成像

在上述实验的基础上进行小鼠肾脏的检测实验，该实验中，首先需要制作动物的肾脏组织切片，组织切片的制作过程如下：从广东省医学动物实中心购买3只Balb/c 雄性小鼠，6～7周龄，质量约为20 g，通过断颈法将3只小鼠致死，1 h后，取出小鼠肾脏，放在-80 ℃的冰箱中保存冷冻，约30 min后，取出肾脏组织，放在徕卡冷冻切片机上切片，切片的厚度控制在250 μm左右，将切片转移到样品杆上，接着向组织切片上均匀滴加10 μL 1 mg/L的吖啶黄素标准溶液，待组织风干后在质谱仪中检测. 探测获得的成像如图6所示.

图6 组织成像图

3 结论

通过将探测获得的质谱图与实物图进行对比，所提出的分子成像技术很好地呈现了抗肿瘤药物吖啶黄素在组织当中的空间分布，分辨率可达100 μm，且单一成像点检测极限低于0.1 pmol. 与传统的质谱成像方法(如基质辅助激光解析电离质谱成像、电喷雾解析电离质谱成像等)相比，本文的红外激光解析/真空紫外激光后电离质谱成像法具有样品前处理简单、耗时短、无基质干扰、可重复性好等优点. 此外，该方法还可以从时间和空间上进行单独优化，这是其他的方法无法做到的. 在未来几年，随着质谱成像技术的不断完善与发展，这种新型的生物组织质谱成像方法将在临床医学上具有很大的应用前景，尤其是在肾脏疾病诊断和药物开发领域具有不可忽视的作用.

[1] FENG B,ZHANG J,CHANG C,et al. Ambient mass spectrometry imaging: plasma assisted laser desorption ionization mass spectrometry imaging and its applications[J]. Analytical Chemistry,2014,86(9):4164-4169.

[2] LIU X,HUMMON A B. Mass spectrometry imaging of therapeutics from animal models to three-dimensional cell cultures[J]. Analytical Chemistry,2015,87(19):9508-9519.

[3] 郭帅,李智立. 质谱成像及其在生物医学领域的应用[J]. 生物物理学报,2011,27(12):1008-1018.

GUO S,LI Z L. Mass spectrometry imaging and its application in biomedical fields[J].Acta Biophysica Sinica,2011,27(12):1008-1018.

[4] YANG Q,HU Y,WEI Y,et al. In situ detection of methylene blue in tissues by laser desorption vacuum ultraviolet single photon postionization mass spectrometry[J]. International Journal of Mass Spectrometry,2013,353(11):12-18.

[5] LIU P,HU Y,ZHU G,et al. Direct and fast detection of chlorothalonil in soil samples using laser desorption VUV single photon post-ionization mass spectrometry[J]. Analytical Methods,2015,7(16):6890-6895.

[6] ZENOBI R. Spatially resolved in-situ analysis of polymer additives by two-step laser mass spectrometry[J]. Macromolecules,1996,29(24):7865-7871.

[7] DALE M J,JONES A C,LANGRIDGESMITH P R R,et al. Laser desorption laser photoionization time-of-flight mass spectrometry of dyes[J]. Analytical Chemistry,1993,65(6):356-357.

[8] HALL R B. Pulsed-laser-induced desorption studies of the kinetics of surface reactions[J]. Journal of Physical Chemistry,1987,91(5):1007-1015.

[9] MAECHLING C R,CLEMETT S J,ENGELKE F,et al. Evidence for thermalization of surface-desorbed molecules at heating rates of 108 K/s[J]. Journal of Chemical Physics,1996,104(21):8768-8776.

[10]ENGELKE F,HAHN J H,HENKE W,et al. Determination of phenylthiohydantoin-amino acids by two-step laser desorption multiphoton ionization [J]. Analytical Chemistry,1987,59: 909-912.

[11]MELVIN B M T,AKHMETOV A,AYDIN B,et al. Quantification of antibiotic in biofilm-inhibiting multilayers by 7.87 eV laser desorption postionization MS imaging[J]. Analytical Chemistry,2012,84(21):9410-9415.

[12]AKHMETOV A,MOORE J F,GASPER G L,et al. Laser desorption postionization for imaging MS of biological material[J]. Journal of Mass Spectrometry,2010,45(2):137-145.

[13]LIU P,HU Y,ZHU G,et al. Direct and fast detection of chlorothalonil in soil samples using laser desorption VUV single photon post-ionization mass spectrometry [J]. Analytical Methods,2015,7(16):6890-6895.

[14]LEE C J,YUE C H,LIN Y Y,et al. Antitumor activity of acriflavine in human hepatocellular carcinoma cells[J]. Anticancer Research,2014,34(7):3549-3556.

[15]LEE K,ZHANG H,QIAN D Z,et al. Acriflavine inhibits HIF-1 dimerization,tumor growth,and vascularization[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America,2009,106(42):17910-17915.

【中文责编：成文 英文责编：肖菁】

A New Mass Spectrometry Imaging Technique for Biological Tissue and Instruments Integration

HU Yongjun*, CHEN Jiaxin, LU Qiao

(College of Biophotonics, South China Normal University, Guangzhou 510631, China)

A new mass imaging technique for biological tissues using laser desorption postionization mass spectrometry is proposed. This technique does not require multiple sample preparation and avoids the spectra interferences. Moreover, this imaging method can be used to optimize wavelength independently of two laser beams in time and space. It also can adjust the delay time between the desorption laser and the ionization laser. The first application of this experimental technique was applied successfully to detect the spatial distribution of anticancer drug, c14h15n3cl2, in mouse kidney tissues. This helps us get the best mass spectra and images with a resolution of 100 μm and a limit of 0.1 pmol. All the results show that this new imaging technique is promising in the areas of clinical medicine and medicinal development in the future.

acriflavine; laser desorption ionization; tissue imaging; clinical diagnosis

2016-05-27 《华南师范大学学报(自然科学版)》网址：http://journal.scnu.edu.cn/n

国家自然科学基金项目(21273083, U1332132)

O43

A

1000-5463(2016)06-0063-04

*通讯作者:胡勇军，教授，Email: yjhu@scnu.edu.cn.