小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗抗体水平影响

袁　野，李浩鹏，邢小勇，胡永浩⋆

（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃　兰州　730070；2.中牧股份（乾元浩生物股份有限公司），河南　郑州　450000）

小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗抗体水平影响

袁野1，2，李浩鹏2，邢小勇1，胡永浩1⋆

（1.甘肃农业大学动物医学院，甘肃兰州730070；2.中牧股份（乾元浩生物股份有限公司），河南郑州450000）

本试验旨在研究小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗抗体水平的影响，采用将免疫增强剂小分子发酵抗菌肽分别添加于正常抗原含量及减量抗原含量的新城疫ND-禽流感（H 9 F株）二联灭活苗，禽流感（H 5N 1亚型Re-6株、Re-7株）二价灭活苗中，分别免疫SPF鸡。同时用不加免疫增强剂的新城疫-禽流感二联灭活疫苗和禽流感二价灭活疫苗免疫SPF鸡作为对照组。结果表明，通过监测鸡免疫后不同天数的血清抗体水平，发现抗原用量不变的情况下，试验组比对照组抗体效价均有提高；在抗原用量减少50%的情况下试验组比对照组抗体效价也均有一定的提高。结果提示，小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗能起到一定的抗体增强的效果。

免疫增强剂；小分子发酵抗菌肽；新城疫；禽流感；抗体滴度

新城疫（Newcast le disease，ND）和禽流感（avian inf luenza）是危害禽类的重大疾病，其病原分别是新城疫病毒和禽流感病毒，都属于高度接触性传染病，对世界养禽业危害[1-3]。

目前，新城疫和禽流感的预防主要是接种疫苗[4-5]，鸡新城疫疫苗主要有弱毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗、基因工程苗[6-7]，而弱毒疫苗为目前市场上最常见的疫苗。禽流感现阶段常见的疫苗为全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗、核酸疫苗、重组活载体疫苗[8-9]。虽然使用常规疫苗免疫接种可以防治新城疫、禽流感，但在实际情况下常规单苗存在免疫繁琐，免疫效果不尽理想，成本高等缺点，针对市场的需求，进而研制出既节约成本又增强免疫效果的免疫增强剂。

小分子发酵抗菌肽属于有机肽类，具有广谱抗菌抗病毒活性[10]，无残留，无副作用，无耐药性，热稳定好，耐热100℃，10 min，使用方便，分子质量小，水溶性好，强碱性，还具有抗原虫杀瘤作用[11-13]。使用过小分子发酵抗菌肽的畜禽（如禽饲喂适量）抗病能力增强，生产性能优良，经济效益良好。禽用疫苗的生产成本逐年增高，疫苗客户群对疫苗免疫效果的要求愈高，为能降低灭活苗成本，同时又能增强抗体的实用效果。本研究在正常抗原含量及减量抗原含量下，通过不添加免疫增强剂作为对照组，探讨小分子发酵抗菌肽对鸡体感染新城疫，禽流感的免疫调节作用，为应对新城疫，禽流感能够达到更加理想的免疫预防效果奠定了理论依据[14-17]。

1　材料与方法

1.1试验动物28日龄SPF鸡125只均购自乾元浩生物股份有限公司。

1.2主要试剂小分子发酵抗菌肽：购自中农颖泰生物股份有限公司[99%（纯品）]。二硬脂酸铝：购自温州（20140102）。司本-80：购自广东省肇庆市超能实业有限公司（20131208）。吐温-80：购自广东省肇庆市超能实业有限公司（20130419）

1.3主要仪器M52：购自法国（VG5111304P）。T-18型台式微型剪切机购自德国IKA公司。LS900激光颗粒粒度分析仪购自青岛欧美克公司。八道移液器：购自德国艾本德公司。IKA T10微量乳化机、离心机：购自德国IKA公司。

1.4疫苗疫苗由乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂提供。

1.5小分子发酵抗菌肽的制备

1.5.1小分子发酵抗菌肽水相的制备将5 mg小分子发酵溶于5 mL生理盐水（0.85%）中，使其浓度为1 mg/mL（1μg/μL）；取含灭活抗原的水相2 mL，加入上述小分子发酵溶液80μL，混匀待用，即为小分子发酵免疫增强剂疫苗的水相，最终疫苗中小分子发酵浓度达到10μg/mL。水相最终pH应为6.0～7.0。

1.5.2小分子发酵抗菌肽油相的制备由中国牧工商集团总公司（乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂）提供疫苗油相，小分子发酵免疫增强剂疫苗需要6 mL油相。

1.5.3小分子发酵抗菌肽的乳化按中国牧工商集团总公司（乾元浩生物股份有限公司郑州生物药厂）8 mL体积灭活疫苗配方，进行乳化配苗：将配制好的油相先与小分子发酵抗菌肽的水相用德国IKAT18型高速剪切机先进行预乳化，待将水相加入完全后，按一定转速、时间乳化结束，分装以备用于动物试验。

1.6疫苗物理性状的检测取一清洁吸管，吸取少量疫苗滴于冷水中，应呈油滴状不扩散为宜。

取10 mL疫苗于离心管中，经3 500 r/min离心15 min，应不出现分层现象；疫苗在37℃左右条件，放置21 d不应有破乳现象为佳。

用下口内径为1.2 mm，上口内径为2.7 mm的1 mL移液吸管在25℃左右的条件下吸取疫苗1 mL，令其垂直流出，记录流出0.4 mL所需的时间。

取5μL疫苗混匀于10 mL白油中，置于LS900激光粒度分析仪中检测。

1.7疫苗无菌检测疫苗抽样，分别取硫乙醇酸盐培养基2支，琼脂培养基2支，葡萄糖培养基1支，每支接种疫苗0.2 mL分别放置于37℃，25℃培养箱中做无菌检验。

1.8免疫接种试验取3周龄的SPF鸡125只，分13组：第1～2组每组禽流感（Re-6+Re-7）免疫剂量0.3 mL/羽，第1组添加小分子发酵抗菌肽；第3～4组每组禽流感H9 F株免疫剂量0.2 mL/羽，第3组添加小分子发酵抗菌肽；第5～6组每组新城疫ND免疫剂量20μL/羽；第5组添加小分子发酵抗菌肽；第7～12各组每羽份在原有抗原含量基础上抗原含量全部减半：第7～8组每组禽流感（Re-6+Re-7）免疫剂量0.3 mL/羽，第7组添加小分子发酵抗菌肽；第9～10组每组禽流感H9 F株免疫剂量0.2 mL/羽，第9组添加小分子发酵抗菌肽；第11～12组每组新城疫ND免疫剂量20μL/羽；第11组添加小分子发酵抗菌肽；第13组取5只作为空白对照，不进行免疫接种。

1.9H H I I抗体检测SPF鸡分别在免疫后21、28、35 d采血、测抗体。

2　结果与分析

2.1疫苗物理性状的检测添加小分子发酵抗菌的疫苗颜色无变化，呈乳白色，无破乳现象，且无分层现象，粘度、颗粒度也和普通疫苗无明显差异。

2.2疫苗的无菌检测添加小分子发酵抗菌的各组疫苗均呈无菌状态。

2.3疫苗的免疫试验

2.3.1抗原含量正常时禽流感（Re-6株、Re-7株）疫苗的免疫增强试验结果

图1　Re-6株试验结果Fig.1　Experimental results o f Re-6 diseased plant

图2　Re-7株试验结果Fig.2　Experimental results o f Re-7 diseased plant

免疫后结果显示，抗原含量正常时，由图1和图2可以看出，禽流感H5N1 Re-6株和Re-7株，试验组比对照组均有增强效果。并且，从28 d到35 d，试验组、对照组抗体效价均呈上升趋势；由图1可以看出，Re-6株试验组比对照组抗体效价提高明显，21 d时，提高0.4个滴度，28 d时提高1.0个滴度，35 d时提高1.1个滴度；由图2可以看出，Re-7株试验组比对照组抗体效价均有提高，在21 d时，提高0.7个滴度，28 d时提高0.2个滴度，35d时提高0.2个滴度。

2.3.2抗原含量正常时新城疫ND、禽流感H 9 F株疫苗的免疫增强试验结果

图3　ND试验结果Fig.3　Experim ental results o f ND

图4　H9 F株试验结果Fig.4　Experimental results o f H9 F diseased plant

由图3可以看出，ND试验组比对照组抗体效价略有提高，28 d时提高0.2个滴度，35 d时提高0.4个滴度；由图4可以看出，F株试验组比对照组抗体效价提高明显，其中，21 d时，比对照组提高0.8个滴度，28 d时，比对照组提高0.7个滴度，35 d时，比对照组提高0.3个滴度。

2.3.3抗原含量减半时禽流感（Re-6株、Re-7株）疫苗的免疫增强试验结果

图5　Re-6株试验结果Fig.5　Experimental results of Re-6 diseased p lant

图6　４Re-7株试验结果Fig.6　Experimental results of Re-7 diseased plant

由图5和图6可以看出，Re-6株和Re-7株，试验组比对照组都有一定增强效果；由图5可以看，Re-6株试验组比对照组抗体效价均有提高，21 d时提高0.6个滴度，28 d时提高0.3个滴度，35 d时提高0.1个滴度；由图6可以看出，Re-7株试验组比对照组抗体效价均有提高，21 d时提高0.5个滴度，28 d时提高0.2个滴度，35 d时提高0.6个滴度。

2.3.4抗原含量减半时新城疫ND、禽流感H 9 F株疫苗的免疫增强试验结果

由图7和图8可以看出，ND、F株试验组比对照组均有提高；由图7可以看出，ND试验组比对照组均有提高，21 d时，提高0.5个滴度，28 d时，提高0.5个滴度，35 d时，提高0.4个滴度；由图8可以看出，F株试验组比对照组略有提高，28 d时，提高0.2个滴度，35 d时，提高0.4个滴度。

3　讨论

抗菌肽是一类由原核动物与真核动物体内均能合成的多肽，具有小分子、强阳离子性、热稳定性好、无药物屏蔽且不影响真核细胞等特点。抗菌肽通常作用于细菌，在真核生物的天然免疫方面发挥着重要作用，被认为是古代进化中哺乳动物体内有效保留的免疫分子[14-15]。刘莉如等[16]通过饲粮添加天蚕素抗菌肽可不同程度提高蛋用仔公鸡生长性能、免疫器官指数，并能有效降低前炎性细胞因子基因的mRNA相对表达水平。抗菌肽一般通过饲料添加的方式以提高动物机体的免疫水平，但作为疫苗免疫增强剂研究不多见。本试验通过在抗原量相同的情况下，随着动物免疫天数的逐步增加，对于同种抗原而言，小分子发酵抗菌肽的添加组比同抗原不添加组抗体效价均有所提高，禽流感试验组比对照组抗体效价均有提高，新城疫ND试验组比对照组抗体效价略有提高，禽流感F株试验组比对照组抗体效价提高明显。试验结果表明，在兽医免疫中，小分子发酵抗菌肽可以作为疫苗添加剂以增强免疫效果。

图7　ND试验结果Fig.7　Experim enta l resu lts of ND

图8　H9 F株试验结果Fig.8　Experimental results of H9 F diseased p lant

本试验还通过在抗原用量减少50%的情况下，小分子发酵抗菌肽的添加，使得禽流感试验组比对照组抗体效价有所提高，而新城疫ND试验组比对照组均有提高，禽流感F株试验组比对照组略有提高；在抗原用量减少50%时，试验期望达到正常抗原含量试验中的抗体效价水平，而从不同抗原含量的试验结果看，在抗原用量减少50%情况下，禽流感（Re-6+Re-7）、新城疫ND和禽流感F株抗体效价均比对照组高。本试验对小分子发酵抗菌肽作为禽用疫苗免疫增强剂进行初步研究，试验结果表明，小分子发酵抗菌肽对禽用灭活疫苗能起到抗体增强的效果。小分子发酵抗菌肽作为疫苗增强剂应用前景广泛，但作为疫苗增强剂的最佳添加剂量、添加时间以及免疫增强机制都有待进一步研究。

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Effectof vaccine antibody levels based on Fermentation antim icrobialpeptide of smallmolecule on inactivated vaccine againstavian

Yuan Ye1,2,Li Haopeng2,Xing Xiaoyong1,Hu Yonghao1*
(1.Col lege of Veterinary Medicine of Gansu Agricul tural University,GansuLanzhou730070；2.China Animal Husbandry Industry CO.,LTD.Zhengzhou biological pharmaceutical factory of QYH Biotech Company Limited),HenanZhenzhou450000)

The experiment was conducted to study the impact of antibody levels on antimicrobial peptide of smal l molecule fermentation on inactivated vaccine about avian.We had used the smal l molecule immune enhancer were added to the normal fermentation antibacterial peptide antigen content and the reduction of the antigen content of Newcast le disease ND and avian Inf luenza(H9 F st rain)duplex inactivated vaccine and avian inf luenza H5N1 Re-6 st rain and Re-7 st rain bivalent inactivated vaccine in SPF chickens were immunized.Addition Newcast le disease and avian inf luenza duplex inactivated vaccine and avian inf luenza H5N1 Re-6 strain and Re-7 strain bivalent inactivated vaccine without immune enhancer immunized SPF chickens as a cont rol group.The resul ts showed that monitoring the serum antibody levels of chicken by dif ferent days af ter immunization, the amount of antigen was found under the same circumstances,the experimental group were increased than the control group in antibody titers,and reducing the amount of antigen in hal f of cases in the experimental group were increased than the cont rol group in antibody titers.The studysuggestthatantimicrobialpeptideofsmal lmoleculefermentationinactivatedvaccine against avian antibodies would improve the speci f ic enhanced ef fect.

Immunostimulants;Antimicrobial peptide of smal l molecule fermentation;Newcast le; Avian inf luenza;Titer of antibody

S859.797

B

1672-9692(2016)01-0008-07

2015-11-02

袁野（1983-），男，河南郑州人，博士研究生，主要从事生物制品、药品的研发与生产。

胡永浩（1962-），男，甘肃古浪人，教授，硕士生导师，研究方向为动物传染病学。

国家高新技术研究发展计划（863计划）生物兽药新产品研究和创制（2011AA10A214）。