朝鲜族传统米酒中的乳酸菌多样性分析

苗乘源，郑 琳，程雅韵，金 清，崔泰花

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)



朝鲜族传统米酒中的乳酸菌多样性分析

苗乘源，郑 琳，程雅韵，金 清，崔泰花*

(延边大学农学院，吉林 延吉 133002)

为了分析米酒中乳酸菌的多样性，从2种朝鲜族传统发酵米酒中利用平板稀释法及菌落特征共分离出28株菌株，革兰氏染色观察形态后筛选出11株推定为乳酸菌菌株，再经SDS-PAGE电泳法分析筛选菌株的全细胞蛋白模式，将其划分为2大类，经16s rRNA基因序列分析，确定为发酵乳杆菌，且在2种传统发酵米酒中发酵乳杆菌均参与发酵。

米酒；乳酸菌；SDS-PAGE电泳；16s rRNA

朝鲜族传统米酒是一种老少皆宜的低酒精度的发酵型饮料酒，其酒精含量一般为3%～14%，发酵的主要原料为糯米，经浸米、蒸米、糖化、发酵等工序酿制而成，富含葡萄糖、麦芽糖、氨基酸、维生素、有机酸、多糖等多种营养成分[1]。其米香浓郁，口感醇和，具有补血养颜、舒筋活络、强身健体和延年益寿的功效[2]。在米酒发酵过程中，乳酸菌起到了关键作用。

乳酸菌(Lactic acid bacteria)是一类能利用可发酵糖产生大量乳酸的无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的总称。乳酸菌可分为18个属，共有200多种[3,4],具有防治乳糖不耐症、促进营养物质吸收、改善人体肠道菌群平衡、抑制腐败菌生长、降血脂、降血压的作用，同时还有增强人体免疫力、抗肿瘤、抗衰老等功能[4]。

因此，为了分析米酒中乳酸菌的分布及乳酸菌对米酒的影响，该试验从朝鲜族传统发酵米酒中按照乳酸菌的菌落特征初步分离筛选出乳酸菌，并运用革兰氏染色观察菌株形态进一步筛选乳酸菌,采用SDS-PAGE电泳法分析全细胞蛋白模式，根据蛋白质条带特点对菌株进行归类，最后经16s rRNA基因序列分析对归类菌株进行鉴定。分析朝鲜族传统米酒中乳酸菌的多样性，对研究传统发酵米酒中乳酸菌分布，从而进一步了解乳酸菌分布对米酒发酵特性的影响，为有益乳酸菌的利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 样品

黑米米酒(由延吉市以勒公司提供)，善子米酒(由延吉市善子饭店提供)。

1.1.2 主要试剂

甘氨酸、丙烯酰胺、过硫酸铵、考马斯亮蓝、十二烷基硫酸钠(SDS)、甘油、溴酚蓝、四甲基乙二胺(TEMED)、2-巯基乙醇、三羟甲基氨基甲烷(Tris)等试剂为Sigma公司产品，分子量标准蛋白为Promega公司产品，其他试剂均使用了分析纯国产试剂。

1.1.3 主要仪器

PowerPac 3000电泳仪和3 Cell 电泳槽(美国伯乐公司)；超声波细胞粉碎机(宁波新芝生物科技股份有限公司Scientz-ⅡD)；超净工作台(上海新苗医疗器械机械制造有限公司SW-CJ-1FD)；电热恒温培养箱(上海新苗医疗设备有限公司DNP-9082BS-Ⅲ)；数字酸度计(上海鹏顺科学仪器有限公司PHS-3C)；超低温冷冻箱(美国NUAIRE公司NU-9668E)；高压蒸汽灭菌器(日本TOMY公司SX-700)。

1.1.4 培养基

乳酸菌的筛选和培养选用了添加溴甲酚紫的MRS培养基[5]。

1.2 方法

1.2.1 乳酸菌的筛选与纯化

采用平板稀释法[6,7]。

取2种传统发酵米酒样液作为初始倍数菌液(100)，按10倍梯度递增稀释后均匀涂布于MRS固体培养基上，在37 ℃恒温培养48 h后，挑取乳酸菌菌落特征明显的单个菌落在MRS培养基中37 ℃纯化培养24 h，并按照不同样品、不同稀释度进行编号(黑米米酒，善子米酒中所筛选出的菌株编号字母依次为J、K)。

1.2.2 乳酸菌菌种保藏

将已纯化的乳酸菌菌种接种到1 mL MRS液体培养基中，37 ℃恒温培养24 h后,将菌株培养液0.7 mL与0.3 mL 50%甘油混合，在-80 ℃冷冻冰箱中保存备用[7]。

1.2.3 形态学鉴定

为观察细菌形态,对筛选菌株进行革兰氏染色[8]。

将纯化菌种接种到MRS固体培养基上，37 ℃恒温培养24 h。取生理盐水1滴滴在载玻片上，用接种环取1个单一菌落溶于生理盐水中，用火焰固定，草酸铵结晶紫染色2 min，碘液媒染2 min，95%酒精脱色30 s，蕃红复染2 min，细水清洗干燥后，显微镜观察菌体形态。

1.2.4 乳酸菌全细胞蛋白模式的分析

SDS-PAGE电泳法分析全细胞蛋白模式[9,10]。

将纯化后的乳酸菌在液体MRS培养基中培养后离心,沉淀物用生理盐水清洗、离心，得到菌体加入生理盐水混匀后用细胞粉碎机破碎,破碎溶液为样品作凝胶电泳实验。凝胶浓度分别为分离胶12.5%、浓缩胶5%。分离电压分别为分离胶140 mV、浓缩胶70 mV。 考马斯亮蓝R250染色1 h后用10%乙酸脱色至凝胶背景清晰。

1.2.5 菌种鉴定

利用16s rDNA 基因序列测定方法进行菌种鉴定。代表菌株在MRS液体培养基中培养后离心得到菌体。使用试剂盒提取菌体总DNA[11],总DNA为模板27F(AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(TACCTTGTTACGACTT)为引物进行16s rDNA PCR扩增。所得到的扩增产物经纯化后，由SolGent公司(韩国，大田)测定序列，经BLAST进行同源性分析鉴定到种。

2 结果与分析

2.1 乳酸菌分离和纯化

将收集到的2种米酒梯度稀释后涂布在MRS固体培养基，挑选具有明显乳酸菌菌落特征的菌株，共分离28株菌株，其中，黑米米酒中12株，善子米酒中16株。

2.2 革兰氏染色结果

图1为对黑米米酒、善子米酒中分离菌株进行革兰氏染色后的显微镜观察结果。结果表明，所分离的28株菌株中有11株具有乳酸菌形态特征，其中6株来自黑米米酒，5株来自善子米酒，11株菌株形态均呈杆状。

图1 黑米米酒(J)、善子米酒(K)中代表菌株革兰氏染色 (10×100)

2.3 乳酸菌全细胞蛋白模式分析

根据SDS-PAGE电泳结果显示的主要蛋白质条带厚度、位置、间隙、数量以及分子量差异对菌株进行归类，全细胞蛋白模式相同的菌株视为同类菌种[12]。由图2可知，呈现乳酸菌形态的11株菌株主要为2大类型，具体划分见表1。

图2 SDS-PAGE电泳法分析的乳酸菌菌株的全细胞蛋白模式

2.4 菌种鉴定

对上述通过SDS-PAGE电泳法划分的2大类乳酸菌代表菌株提取总DNA，以分别提取的总DNA为模板，PCR扩增16s rRNA基因片段后，对扩增产物序列进行分析，将所得到的基因序列在 GenBank 中同源序列搜索的结果见表1。由表1可知，代表菌株被鉴定为发酵乳杆菌，且具有较高的同源性(99%以上)。

表1 运用16s rRNA序列鉴定乳酸菌的种类

3 结论

本试验运用平板稀释法从2种传统发酵米酒中分离出28株乳酸菌，经革兰氏染色观察形态后筛选出11株具有乳酸菌形态特征的菌株，利用SDS-PAGE电泳法对菌株全细胞蛋白模式进行分析后，11株菌株被划分为2大类，最后对2大类的代表菌株16s rDNA基因序列进行分析， 11株菌株均被鉴定为发酵乳杆菌，且2种传统发酵米酒的发酵过程均有发酵乳杆菌的参与。

[][]

[1] 吕加平,于景华.乳酸菌发酵剂优良菌种的选育[J].中国乳品工业,2002,50(05):49-52.

[2] 宋北,王继华,杜丛,等.大米酒酒曲中优势菌群的探究[J].哈尔滨师范大学自然科学学报,2010,26(02):69-73.

[3] 王英,周剑忠,陈晓红，等.新疆酸马奶中优良乳酸菌的分离鉴定及发酵特性分析[J].江西农业大学学报,2009,30(05):807-811.

[4] Jin J B,Kim S Y,Jin Q,et al.Diversity Analysis of Lactic Acid Bacteria in Takju,Korean Rice Wine[J].Journal of Microbiology and Biotechnology,2008,18(10):1678-1682

[5] 金红星,田方,成文玉.辣白菜中明串珠菌的筛选及鉴定[J].中国酿造,2009,209(08):82-84.

[6] 崔虎山,黄晓静,王山,等.低温生产高活性右旋糖苷蔗糖酶的明串珠菌的筛选[J].食品科技,2011,36(12):6-9.

[7] 李冬梅,白月娥,李玲,等.SDS-PAGE电泳法分析朝鲜族辣白菜中乳酸菌分布[J].食品科技,2012,37(11):10-13.

[8] 刘晓辉,陈顺,高晓梅,等.酸菜中乳酸菌的分离筛选与鉴定研究[J].中国酿造,2009(02):62-64.

[9] 叶长春.SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳染色方法的改进[J].湖北工业大学学报,2009(04):16-18.

[10] 黄国霞,危雅乐,阎柳娟,等. SDS-PAGE电泳法分析鳖中蛋白质相对分子量分布[J].食品科技,2011,36(11):255-257.

[11] Eom H J,Seo D M,Han N S.Selection of psychrotrophic Leuconostoc spp.producing highly active dextransucrase from lactate fermented vegetables[J].International Journal of Food Microbiology,2007,117(1):62-67

[12] Kim S Y,Yoo K S,Kim J K,et al.Diversity Analysis of Lactic Acid Bacteria in Korean Rice Wines by Culture-independent Method Using PCR-denaturing Gradient Gel Electrophoresis[J].Food Science, Biotechnology, 2010, 19(3): 749-755

Diversity analysis of lactic acid bacteria in traditional Chinese-Korean rice wine

MIAO Chengyuan, ZHENG Lin, CHENG Yayun, JIN Qing, CUI Taihua*

(AgriculturalCollegeofYanbianUniversity,JilinYanji133002,China)

In order to investigate lactic acid bacterial diversity, 28 strains were isolated from the traditional Chinese-Korean rice wine based on the colony morphological characteristics using the dilution plating method. Among these, 11 strains screened out based on the gram staining were inferred as lactate acid bacteria and divided into 2 patterns by whole-cell protein pattern analysis using SDS-PAGE. By 16S rRNA gene sequencing, the strains screened were identified asLactobacillusfermentumparticipating in the fermentation of both traditional rice wines.

rice wine; lactic acid bacteria; SDS-PAGE electrophoresis; 16S rRNA

2015-12-09 基金项目：国家自然科学基金资助项目 (31260362)；延边大学大学生创新创业训练计划项目(ydbksky2015249)

苗乘源(1993—)，女，吉林通化人，在读学士，研究方向为食品微生物发酵。崔泰花为通信作者，

E-mail:Lich@ybu.edu.cn

1004-7999(2016)03-0248-03

10.13478/j.cnki.jasyu.2016.03.012

TS262.4

A