T-SPOT. TB联合血浆细胞因子检测在活动性结核病诊断中的应用

陆小艳,杨 艺,杨 丹

(广西壮族自治区百色市人民医院,1. 感染性疾病科; 2. 呼吸内科,广西 百色,533000)



T-SPOT. TB联合血浆细胞因子检测在活动性结核病诊断中的应用

陆小艳1,杨 艺2,杨 丹1

(广西壮族自治区百色市人民医院,1. 感染性疾病科; 2. 呼吸内科,广西 百色,533000)

目的 探讨结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT. TB)联合血浆细胞因子干扰素-γ(IFN-γ)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-10(IL-10)检测在结核病诊断中的作用。方法 随机选取30例活动性结核病患者为A组,20例非活动性结核病患者为B组,30例健康体检者为C组。各组分别行外周血T-SPOT. TB检测，并采用ELISA法检测血浆IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。比较A、B组T-SPOT. TB阳性患者各孔斑点数；比较3组血浆IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10浓度。通过绘制ROC曲线，对T-SPOT. TB试验、血浆细胞因子水平在鉴别活动性与非活动性结核中的价值进行分析。结果 当T-SPOT. TB结果为阳性时,A组患者B孔斑点数明显多于B组，得出ROC曲线下面积AUC是0.689(P<0.05)，为有效诊断指标。A、B组的IFN-γ、IL-10水平存在统计学差异，均为有效诊断指标(P<0.05或P<0.01)。结论 T-SPOT. TB联合血浆IFN-γ、IL-10浓度检测对判断结核是否具有活动性有较高价值。

结核; IFN-γ; IL-2; IL-4; IL-10; 结核感染T细胞斑点试验; 诊断

结核病是致病菌为结核分歧杆菌的慢性传染性疾病，全球每年约有150万人因结核病而死亡，中国结核病每年患病人数高居全球第二。目前，对肺结核病的诊断仍是医疗界面临的重要挑战。结核感染T细胞斑点试验(T-SPOT. TB)在结核病的诊断方面具有较高的敏感性及特异性，但在区分结核活动性与否方面尚不理想，而临床上对于活动性结核病与非活动性结核病的治疗措施截然不同，对两者的鉴别诊断亦尤为重要。研究[1]表明，当机体感染结核分歧杆菌后大多数处于潜伏感染状态，当某些原因引起机体发生免疫功能紊乱时，感染可再活化，即发生活动性结核病。可见，机体的免疫状态与结核病的活动性密切相关。有研究[2]认为，在结核病的不同状态，血浆中某些细胞因子水平可发生不同程度的变化，增加检测的不稳定性。本研究分别选取了细胞免疫与体液免疫相关细胞因子作为检测指标，探讨其在结核病诊断中的作用，尤其是活动性结核病与非活动性结核病的鉴别诊断，进一步了解抗结核的免疫机制。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年10月—2015年12月百色市人民医院住院的30例活动性结核病患者为A组,20例非活动性结核病患者为B组。2组均经细菌学或组织学检查并经临床诊断证实。排除患有严重肝肾疾患、自身免疫性疾病、HIV感染、妊娠、近期使用过免疫抑制类药物的患者。A组男22例，女8例；年龄19～78岁，平均(55.1±2.6)岁；其中包括活动性肺结核18例，肠结核2例，结核性心包炎2例，结核性脑膜炎2例，结核性腹膜炎2例，结核性胸膜炎1例，结核性胸膜炎合并肺结核2例，结核性心包炎合并胸膜炎1例。B组男12例，女8例；年龄22～80岁，平均(54.9±2.5)岁；其中包括陈旧性肺结核病15例，陈旧性结核性胸膜炎1例，结核潜伏感染4例。另随机选取同期健康体检的健康者30例为C组，其中男16例，女14例；年龄19～80岁，平均(54.8±2.9)岁。3组一般资料比较无显著差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 T-SPOT. TB试验方法：各组入院后分别行外周血T-SPOT. TB检测。真空肝素钠抗凝管采集外周静脉血5 mL,常温静置2 h后送检。T-SPOT. TB试剂盒购自上海复星高科技有限公司，实验步骤严格按照产品说明书逐步进行。试验结束后，光镜下观察试验结果，进行斑点计数。

1.2.2 血浆细胞因子检测方法: A、B组入院后均行血浆细胞因子检测,C组与门诊行检测。真空肝素钠抗凝管采集外周静脉血5 mL,常温静置2 h后3 000 r/min离心10 min,收集血浆,ELISA法检测血浆中IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平。ELISA试剂盒购自R&D公司。

1.3 观察指标

比较A、B组T-SPOT. TB阳性患者各孔斑点数；比较3组血浆IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10浓度。通过绘制ROC曲线，对T-SPOT. TB试验、血浆细胞因子水平在鉴别活动性与非活动性结核中的价值进行分析。

若斑点计数为以下情况则判断为阳性: ① 当阴性对照孔斑点数<6,A、B孔斑点数与阴性对照孔斑点数之差≥6时; ② 当10>阴性对照孔斑点数≥6时，如果A或B孔斑点数≥阴性孔斑点数×2。当达不到上述标准，且阳性对照孔斑点数≥20,判断为阴性，表明患者体内不具针对MTB的效应T淋巴细胞。

1.4 统计学方法

2 结 果

2.1 T-SPOT. TB试验结果

A组中T-SPOT. TB阳性28例，阴性2例; B组中T-SPOT. TB阳性19例，阴性1例。C组T-SPOT. TB均为阴性。A组T-SPOT. TB阳性患者A孔斑点数1～205个，平均24.01个; B孔斑点数1～390个，平均75.51个; A、B孔斑点数之和为11～563个，平均112.5个。B组T-SPOT. TB阳性患者A孔斑点数1～163个，平均19个; B孔斑点数1～238个，平均26.01个; A、B孔斑点数之和为8～395个，平均50.51个。

图1 2组T-SPOT.TB阳性患者A孔斑点数

图2 2组T-SPOT.TB阳性患者B孔斑点数

图3 2组T-SPOT.TB阳性患者A+B孔斑点数

采用GraphPad Prism 5 软件对2组T-SPOT. TB阳性患者A、B孔斑点数进行散点图绘制，统计学分析显示A、B组T-SPOT. TB阳性患者A孔斑点数比较无显著差异(P>0.05),如图1-1; A组T-SPOT. TB阳性患者B孔斑点数明显多于B组T-SPOT. TB阳性患者，差异有统计学意义(P<0.05),如图1-2; 2组T-SPOT. TB阳性患者A+B孔斑点数之和比较无显著差异(P>0.05),见图1、2、3。

2.2 各组血浆细胞因子水平比较

各组血浆IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10存在不同程度的差异。A组IFN-γ、IL-10水平明显高于B、C组; A、B组IL-2水平明显低于C组,IL-4水平明显高于C组; B组IL-10水平明显高于C组；以上组间比较差异均有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组血浆细胞因子水平比较 pg/mL

2.3 T-SPOT. TB试验、血浆细胞因子水平对活动性与非活动性结核的诊断价值

2.3.1 T-SPOT. TB试验：当T-SPOT. TB结果为阳性时，A组患者B孔斑点数明显多于B组。进一步进行ROC曲线分析，得出ROC曲线下面积(AUC)=0.689(P<0.05),为有效诊断指标。B孔斑点数对活动性与非活动性结核诊断的灵敏度为50.0%,特异度为88.5%,阳性似然比为4.67,阴性似然比为0.65。

2.3.2 血浆细胞因子水平：A组和B组的IFN-γ、IL-10水平存在显著差异。进一步进行血浆IFN-γ浓度ROC曲线分析，得出AUC=0.925(P<0.01)，为有效诊断指标，对活动性与非活动性结核的鉴别，灵敏度为93.5%,特异度为86.0%,阳性似然比为6.22,阴性似然比为0.06。进一步进行血浆IL-10浓度ROC 曲线分析，得出AUC=0.891(P<0.01),为有效诊断指标，对活动性与非活动性结核的鉴别，灵敏度为93.6%,特异度为90.0%,阳性似然比为9.32,阴性似然比为0.06。

3 讨 论

人体感染结核分歧杆菌后的发病与结核分歧杆菌的数量、毒力、机体免疫力等因素密切相关。大部分人感染结核分歧杆菌后处于潜伏状态，此时，机体所感染的结核分歧杆菌在体内以静止形式存在。当机体由于某些原因发生免疫力下降时，结核杆菌可能由静止状态转化为活化状态，此时潜伏感染转变为活动性结核病[3-4]。机体抗结核免疫反应主要依赖巨噬细胞参与的细胞免疫，整个过程受多种细胞因子调节。Th1型细胞因子能够增加巨噬细胞抗菌活性，有利于对结核病的控制[5]; Th2型细胞因子可降低巨噬细胞的抗菌活性，促进结核病的发展[6]。Th1/Th2的动态平衡决定了结核病的发生发展。

本研究选取了IFN-γ和IL-2(Th1型细胞因子)、IL-4和IL-10(Th2型细胞因子)作为研究指标。结果显示，A组(活动性结核病患者)血浆IFN-γ、IL-10浓度明显高于B组(非活动性结核病患者)和C组(健康体检者)，这与相关文献[7-8]报道一致。可见，机体感染结核分歧杆菌后,Th1型细胞免疫反应增强,T淋巴细胞产生IFN-γ水平增加。B组与C组间比较，血浆IFN-γ水平未见明显差异，分析可能是由于非活动性结核病患者中大部分为陈旧性结核病患者的原因。IFN-γ能够促进巨噬细胞活化，增加其抗原提呈作用，在控制结核感染中发挥重要作用[9]。本研究还发现，活动性结核病患者血浆中IL-10水平明显高于非活动性结核病患者。说明活动性结核病换成存在明显的免疫紊乱现象,Th1/Th2细胞因子失衡明显。IL-10能够抑制促炎因子的产生，通过对抗原提呈细胞活性的抑制发挥阻止T淋巴细胞活化的作用[10]。本研究通过对A、B组患者血浆IFN-γ、IL-10浓度进行ROC曲线分析，得出IFN-γ曲线下面积AUC=0.925,IL-10曲线下面积AUC=0.891,可见2种细胞因子在活动性与非活动性结核病的鉴别诊断中均具有较高价值，其中IL-10的阳性似然比明显高于IFN-γ,可见IL-10更有助于对活动性结核病的诊断。

T-SPOT. TB试验在结核病的诊断方面具有较高的特异性，且不受机体免疫状态影响。Suzukawa[11]等在对T-SPOT. TB试验相关文献进行的Meta分析中报道,T-SPOT. TB对结核病的诊断综合灵敏度为90%,特异度为93%。Donnachie等[12]在研究中称,T-SPOT. TB对活动性结核病的诊断灵敏度是92.1%,特异度是82.5%。在T-SPOT. TB试验中，每个斑点代表一个致敏的T淋巴细胞，斑点数目的增加也就反应了结核病的活动性。本研究中，活动性结核病患者与非活动性结核病患者的A孔斑点数、A孔与B孔斑点总数无明显差异，而活动性结核病患者B孔斑点数明显高于非活动性结核病患者，这与其他报道相一致[13-15]。通过对各组B孔斑点数进行ROC曲线分析,AUC=0.689,灵敏度为50.0%,特异度为88.5%。可见T-SPOT. TB试验B孔斑点数虽为有效诊断指标，但诊断价值较低。

综上所述,Th1/Th2细胞因子动态失衡在结核病的发生发展中发挥重要作用; T-SPOT. TB联合血浆ELISA 的IFN-γ、IL-10浓度检测在结核病的诊断中具有较高价值。患者入院后可先行T-SPOT. TB检测，结果呈阳性时，进一步进行IFN-γ、IL-10浓度测定，以区分结核病的活动性，指导治疗。

[1] Teramura Y,Kameda K,Kanda J,et al. Development tuberculous meningitis during chemotherapy for CD5-positive diffuse large B-cell lymphoma[J]. Rinsho Ketsueki,2016,57(5): 597-601.

[2] 沈洪波,陈维政. 结核分歧杆菌潜伏感染的免疫机制及免疫干预研究进展[J]. 中华结核和呼吸杂志,2016,39(1): 47-51.

[3] 沙巍. 结核分歧杆菌潜伏感染的化学预防干预[J]. 中华结核和呼吸杂志,2016,39(1): 13-15.

[4] Seto J,Suzuki Y,Ahiko T. Comparison of QuantiFERON? TB gold test results before and after endotoxin contamination [J]. Kekkaku,2016,91(2): 49-52.

[5] 孙娜,张丽萍. 初治结核病与复治结核病患者外周血T细胞亚群的变化分析[J]. 中国医药指南,2016,14(9): 183-184.

[6] Muchaidze R D,Dantsev V V,Beznosik R V,et al. Importance of social tuberculosis prophylaxis for the Armed Forces in present conditions[J]. Voen Med Zh,2016,337(2): 9-12.

[7] 张长桂,周兴军,姚晓燕,等. γ-干扰素释放试验和PPD试验在处置学校结核病暴发疫情中的应用分析[J]. 中国学校卫生,2016,37(2): 311-313.

[8] Butov D O,Kuzhko M M,Makeeva N I,et al. Association of interleukins genes polymorphisms with multi-drug resistant tuberculosis in Ukrainian population[J]. Pneumonol Alergol Pol,2016,84(3): 168-173.

[9] 吴妍,李琦,张宗德. γ-干扰素释放试验对老年肺结核的辅助诊断价值[J]. 中国防痨杂志,2016,38(2): 122-128.

[10] Abdalla A E,Lambert N,Duan X,et al. Interleukin-10 family and tuberculosis: an old story renewed[J]. Int J Biol Sci,2016,12(6): 710-717.

[11] Suzukawa M,Akashi S,Nagai H,et al. Combined analysis of IFN-γ,IL-2,IL-5,IL-10,IL-1RA and MCP-1 in QFT supernatant is useful for distinguishing active tuberculosis from latent infection[J]. PLoS One,2016,11(4): e0152483.

[12] Donnachie E,Fedotova E P,Hwang S A. Trehalose 6,6-Dimycolate from mycobacterium tuberculosis induces hypercoagulation[J]. Am J Pathol,2016,186(5): 1221-1233.

[13] 郭永莉. 干扰素诱导蛋白10对活动性结核病和潜伏性结核感染的临床价值[J]. 临床肺科杂志,2016,21(4): 752-754.

[14] Phuah J,Wong E A,Gideon H P,et al. Effects of B cell depletion on early mycobacterium tuberculosis infection in cynomolgus macaques[J]. Infect Immun,2016,84(5): 1301-1311.

[15] Gleeson L E,Sheedy F J,Palsson-McDermott E M,et al. Cutting edge: mycobacterium tuberculosis induces aerobic glycolysis in human alveolar macrophages that is required for control of intracellular bacillary replication[J]. J Immunol,2016,196(6): 2444-2449.

Value of T-SPOT. TB combined with plasma cytokines in diagnosis of active tuberculosis

LU Xiaoyan1,YANG Yi2,YANG Dan1

(1.DepartmentofInfectiousDiseases; 2.DepartmentofRespiratoryMedicine,People′sHospitalofBaise,Baise,Guangxi,533000)

Objective To explore the value of T-SPOT. TB combined with interferon (IFN)-γ,interleukin (IL)-2,IL-4,IL-10 in diagnosis of tuberculosis (TB). Methods Thirty patients with active TB were designed as group A,20 patients with inactive TB were designed as group B,and 30 healthy examined people were designed as group C. Each group was conducted with peripheral blood T-SPOT. TB test,and the levels of plasma IFN-γ,IL-2,IL-4,and IL-10 were detected by ELISA method. The number of each hole SPOT of T-SPOT. TB-positive patients were compared between group A and group B,and the levels of plasma IFN-γ,IL-2,IL-4,and IL-10 were compared among three groups. Receiver operating characteristic (ROC) curve was drawn for assessing the value of T-SPOT. TB test and plasma cytokines in the differential diagnosis of active TB and inactive TB. Results When T-SPOT. TB result was positive,the number of B hole SPOT of T-SPOT was obviously higher in group A than group B,and the area under the ROC curve (AUC) was 0.689 (P<0.05),which indicating it was a effective diagnostic index. There were significant differences between group A and group B in the levels of IFN-γ and IL-10 (P<0.05 orP<0.01). Conclusion T-SPOT. TB combined with the detection of plasma IFN-γ and IL-10 concentration has a high diagnostic value in the assessment of whether TB is active or not.

tuberculosis; IFN-γ; IL-2; IL-4; IL-10; T-SPOT. TB test; diagnosis

2016-01-06

中国高校医学期刊临床专项资金(11527840)

R 825.2

A

1672-2353(2016)21-041-04

10.7619/jcmp.201621013