拟南芥rd29A启动子的克隆及植物表达载体构建

申丽婕++于月华++刘娜++梁承娟++汪晓东++谷月好++崔雪++张振清++倪志勇

摘要：以拟南芥（Arabidopsis thaliana）基因组DNA为材料，根据GenBank中拟南芥rd29A启动子序列设计引物，采用PCR克隆一段长度为951 bp的rd29A启动子序列。采用PlantCARE启动子在线预测工具分析表明，rd29A启动子序列具有TATA-box、CAAT-box基本的顺式作用元件和1个脱落酸应答元件（ABRE）和2个脱水应答调控元件（DRE）。将rd29A启动子序列亚克隆到pcambia3301载体的多克隆位点，构建了由rd29A启动子驱动的植物表达载体。

关键词：拟南芥（Arabidopsis thaliana）；rd29A；启动子；植物表达载体

中图分类号：Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）18-4824-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.049

干旱、盐碱和极端温度等非生物胁迫严重影响植物的生长和发育，造成作物减产甚至绝收[1，2]。目前，利用基因工程方法改良植物的抗逆性是一种高效的方法[3-5]。许多基因参与植物对非生物胁迫的应答，其中转录因子因其在转录调控中发挥重要的作用，成为抗逆转基因育种的重要候选基因资源[6]。然而，在正常的条件下，某些非生物胁迫应答转录因子的过量表达，有可能导致植株生长缓慢[7-10]。利用非生物逆境诱导启动子驱动抗逆基因的表达是解决上述问题的一个方法。拟南芥（Arabidopsis thaliana） rd29A启动子受干旱、高盐和低温胁迫诱导表达，在抗逆转基因育种中应用十分广泛[11-13]。例如，rd29A启动子驱动拟南芥AtNHX1基因转化烟草，盐胁迫下转基因烟草相比野生型根发生能力和生长势显著提高且叶片丙二醛含量降低[14]。低温胁迫下，转rd29A-ICE1基因的水稻相比对照的脯氨酸含量和存活率明显提高，丙二醛含量积累速率明显下降，增强了对低温胁迫的忍耐能力[15]。为了便于采用rd29A启动子驱动抗逆基因的表达，本研究根据GenBank中拟南芥rd29A序列设计引物，从拟南芥叶片基因组DNA中克隆了rd29A启动子序列，并亚克隆至植物表达载体pcambia3301的多克隆位点处，为进一步利用诱导型启动子rd29A奠定试验基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 拟南芥Col-0生态型种子由中国农业科学院作物科学研究所作物种质资源中心抗逆研究课题组提供。

1.1.2 试剂与药品 大肠杆菌（Escherichia coli）DH5α感受态细胞、植物基因组DNA提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购于北京天根生化科技有限公司；TransStartTM Taq DNA Polymerase购于北京全式金生物技术有限公司；快速限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ，T4 DNA连接酶购于Fermentas公司；植物表达载体pcambia3301为新疆农业大学农业生物技术重点实验室保存；其他化学药品为国产分析纯。引物和测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 拟南芥叶片基因组DNA的提取 使用植物基因组试剂盒提取拟南芥叶片基因组DNA，采用1%的琼脂糖凝胶检测DNA的完整性。

1.2.2 rd29A启动子克隆及载体构建 根据GenBank中rd29A的启动子序列（GenBank登录号为：D13044）设计带有酶切位点的引物nrd29A-F： 5′-TTTAAGCTTGATGGAGGAGCCATAGATGC-3′和

nrd29A-R：5′-ATAGGATCCTTTCCAAAGATTTTTTT

CTTTCCA-3′（下划线分别表示Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点），以拟南芥叶片DNA作为模板，使用TransStartTM Taq DNA Polymerase进行PCR扩增，按照说明书中推荐的PCR体系和反应程序进行扩增。PCR产物经1.2%琼脂糖电泳检测后，切胶回收，使用Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切rd29A启动子序列和pcambia3301载体，将rd29A启动子序列亚克隆至pcambia3301载体的多克隆位点处，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，将阳性克隆送上海美吉生物医药科技有限公司测序鉴定。

1.2.3 rd29A启动子序列分析 利用DNAMAN软件比对测序序列与GenBank中rd29A的启动子序列的一致性。在PlantCARE网站（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在线分析rd29A启动子区域存在的可能的基本启动子元件和顺式作用元件。

2 结果与分析

2.1 拟南芥rd29A启动子的克隆

根据GenBank中拟南芥rd29A启动子序列设计引物，采用PCR方法从拟南芥叶片基因组DNA中扩增获得大小为951 bp的片段（图1）。测序结果表明，扩增得到的rd29A启动子序列与GenBank中的序列一致性达到99.47%，说明克隆的序列为拟南芥rd29A启动子序列。

2.2 拟南芥rd29A启动子植物表达载体构建

用限制性内切酶Hind Ⅲ和BamH Ⅰ双酶切获得951 bp的rd29A启动子序列，将其连接到植物表达载体pcambia3301的多克隆位点处，转化大肠杆菌后，挑取阳性克隆，对重组质粒菌液进行PCR检测，获得大小为951 bp的扩增片段（图2），经测序验证后，表明已经成功地将拟南芥的rd29A启动子亚克隆至植物表达载体pcambia3301。

2.3 rd29A启动子序列分析

使用PlantCARE网站分析rd29A启动子区域存在的顺式作用元件，分析发现rd29A启动子含有TATA-box和CAAT-box基本启动子元件，1个脱落酸应答元件（ABRE）和2个脱水应答调控元件（DRE）（图3），分析结果表明，克隆的拟南芥rd29A启动子具有逆境诱导启动子的特征。

3 小结与讨论

本研究从拟南芥叶片基因组DNA中克隆了逆境诱导型启动子rd29A，与GenBank中的拟南芥rd29A序列（D13044）比对发现两者的一致性为99.47%，DRE和ABRE元件两者完全一致。产生序列差异的原因有可能是由于使用的聚合酶保真性不高。李新玲等[12]克隆的rd29A片段与D13044有99%的一致性；杨春霞等[13]克隆的rd29A启动子与NCBI上已报道rd29A的启动子（AY973635）有99.64%的一致性。许多报道已经表明位于DRE和ABRE元件之外的突变核苷酸并不影响rd29A启动子的活性[12，13，16]，因此可以推断本研究克隆的rd29A启动子具有诱导活性。本研究将rd29A启动子亚克隆至植物表达载体pcambia3301的多克隆位点处，为利用rd29A启动子驱动抗逆基因的表达奠定了基础。

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