中平树中东莨菪内酯的分离鉴定及含量测定

黄建猷++卢文杰++谭晓++陆国寿++黄周锋++兰保强

摘要：采用硅胶柱色谱分离纯化的方法从中平树[Macaranga denticulata （Bl.） Muell. Arg.]中分离得到一种香豆素类化合物，根据理化性质及光谱数据鉴定其为东莨菪内酯。并采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇∶0.1%冰醋酸（39∶61）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长345 nm的色谱条件，用HPLC法测定中平树中东莨菪内酯的含量。结果表明，东莨菪内酯在1.45～7.24 μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为99.18%，RSD为1.18%（n=6）。该方法简便、准确、快速，可用于中平树药材的质量控制。

关键词：中平树[Macaranga denticulata （Bl.） Muell. Arg.]；东莨菪内酯；分离纯化；高效液相色谱法

中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）18-4805-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2016.18.044

中平树[Macaranga denticulata（Bl.） Muell. Arg.]为大戟科血桐属植物，又名血桐、糠皮树、赖麻、牢麻等，分布于广东、广西、贵州、云南、西藏等地。其根味苦，性凉。具有清热利湿、退黄的功能，主治黄疸型肝炎，胃脘疼痛[1]。广西民间主要用其根部治疗黄疸性肝炎方面的疾病[2]，应用前景广阔。为探明中平树根的化学物质基础，本试验从中平树药材中分离鉴定得到了东莨菪内酯，并采用高效液相色谱法对其含量进行了测定，该方法可用于中平树药材的质量控制。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

中平树采自广西马上县，由广西中医药研究院何开家主任中药师鉴定为中平树。东莨菪内酯对照品为从中平树中提取分离获得，经结构鉴定并采用HPLC归一化法测得含量大于98%后使用；甲醇为色谱纯；水为去离子水；其余试剂为分析纯。

1.2 仪器

IR-470型红外光谱仪、LC-10AT型高效液相色谱仪、威玛龙色谱工作站、AUW220D型分析天平、AEL-200型分析天平（日本岛津公司），DRX-500MHz型超导核磁共振仪（瑞士布鲁克公司），ZDM-83-1型电热熔点仪（江苏科教玻璃仪器厂），KQ-500DB型数控超声波清洗器（昆明市超声仪器有限公司），HH-S2型数显恒温水浴锅（金坛市医疗仪器厂），SHB-III型循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 提取分离 中平树粉碎成粗粉，称取12 kg，加8倍体积95%乙醇浸泡过夜后加热回流提取4次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇，得浸膏。浸膏加入海沙使其分散均匀，依次用石油醚（60～90 ℃）、乙酸乙酯回流提取，回收溶剂后分别得到石油醚部位及乙酸乙酯部位。取乙酸乙酯部位进行硅胶柱色谱分离，用石油醚（60～90 ℃）—乙酸乙酯混合溶剂（100∶0→70∶30）梯度洗脱，共收集265个流分。采用薄层鉴别将各流份分别合并，将第150流份到第183流份合并，反复柱层析及重结晶得到黄色针状结晶。

1.3.2 对照品溶液的制备 精密称取东莨菪内酯对照品3.62 mg置于250 mL量瓶，用甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，得浓度为14.48 μg/mL的对照品储备液，备用。精密量取14.48 μg/mL的对照品储备液3.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得浓度为4.34 μg/mL的对照品溶液。

1.3.3 供试品溶液的制备 精密称定中平树药材粉末（过40目筛）2.0 g，置烧瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过。精密量取续滤液25 mL，置烧瓶中，浓缩至约1 mL，加3 mol/L盐酸溶液10 mL，水浴中加热水解1 h，立即冷却，移入分液漏斗中，用水10 mL洗涤容器，并入分液漏斗中，用氯仿强力振摇5次，每次15 mL，合并氯仿液，立即加甲醇使溶解，转移至10 mL量瓶中，并稀释至刻度，摇匀，即得。

1.3.4 色谱条件 采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇∶0.1%冰醋酸水溶液（39∶61），流速1.0 mL/min，柱温为室温，检测波长345 nm。分别精密吸取东莨菪内酯对照品、供试品和空白溶液各10 μL，进样分析，记录色谱图（图1、图2）。理论塔板数按东莨菪内酯计算应不低于3 000，东莨菪内酯峰与相邻峰的分离度大于1.5，供试品中其他成分不干扰测定。

2 结果与分析

2.1 东莨菪内酯的结构鉴定

黄色针状结晶（氯仿），m.p.：202～204 ℃，EI-MS m/z：192[M+]。1H NMR（500 MHz，MeOD）δ 7.85 （1H，d，J=9.4 Hz，H-4），7.11（1H，s，H-8），6.77（1H，s，H-5），6.20（1H，d，J=9.4 Hz，H-3），4.91（1H，s，-OH），3.91（3H，s，-OCH3）；13C NMR（125 MHz，MeOD）δ 164.0（C-2），112.6（C-3），146.1（C-4），109.8（C-5），147.0（C-6），152.9（C-7），103.9（C-8），151.4（C-9），112.5（C-10），56.8（OCH3）。该数据与文献[3]一致，鉴定为东莨菪内酯（Scopoletin），东莨菪内酯的化学结构见图3。

2.2 东莨菪内酯的含量测定

2.2.1 线性关系考察 分别精密吸取东莨菪内酯对照品储备液1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度。精密吸取上述系列浓度对照品溶液各10 μL，进样测定。以对照品浓度（μg/mL）为横坐标X，色谱峰面积为纵坐标Y，得回归方程为：Y=42 817X-9 136（r=0.999 9），东莨菪内酯1.45～7.24 μg/mL与峰面积呈良好的线性关系。

2.2.2 精密度试验 取对照品溶液，按“1.3.4”色谱条件连续进样6次，记录峰面积，计算得东莨菪内酯峰面积的RSD为0.51%，表明该仪器精密度良好。

2.2.3 重复性试验 取同一批样品6份，按“1.3.3”制备供试品溶液并进样测定，计算得东莨菪内酯的平均含量为36.486 6 μg/g，RSD为1.13%，表明该方法重复性良好。

2.2.4 稳定性试验 取同一批供试液，分别于制备后0、2、4、6、12、24 h进样测定，计算东莨菪内酯峰面积的RSD为1.08%，表明供试品溶液的稳定性良好。

2.2.5 加样回收率试验 精密称取已知东莨菪内酯含量的中平树药材粉末1.0 g，共6份，分别加入一定量的对照品溶液，按“1.3.3”制备供试品溶液并进行测定，东莨菪内酯的回收率见表1。

2.2.6 样品的测定 取3批中平树药材，按”1.3.3”制备供试品溶液，取10 μL进样测定，计算得3批样品中东莨菪内酯的平均含量分别为41.253 6、50.356 8、39.423 5 μg/g；RSD分别为1.23%、1.89%、1.33%（n=3）。

3 小结与讨论

文献[4-10]分别考察了以甲醇、乙醇、70%乙醇为提取溶剂，冷浸、超声、回流3种提取方法以及提取时间对东莨菪内酯提取效率的影响。结果表明，70%乙醇回流提取1 h的效果最佳。

本研究采用硅胶柱色谱分离纯化的方法从中平树[Macaranga denticulata （Bl.） Muell. Arg.]药材中分离得到一种香豆素类化合物，根据理化性质及光谱数据鉴定其为东莨菪内酯，并采用ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇∶0.1%冰醋酸（39∶61）为流动相，流速1.0 mL/min，检测波长345 nm的色谱条件，用HPLC法测定中平树中东莨菪内酯的含量。结果表明，东莨菪内酯在1.45～7.24 μg/mL范围内与其峰面积呈良好的线性关系，平均回收率为99.18%，RSD为1.18%（n=6）。该方法简便、准确、快速，可用于中平树药材的质量控制。

参考文献：

[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（第四册）[M].上海：上海科学技术出版社，1999.826-827.

[2] 广西中医药研究所编.广西药用植物名录[M].南宁：广西人民出版社，1986.

[3] 夏郭平，冯 煦，陈 雨，等.北美盐角草（Salicornia bigelovii Torr.）化学成分的研究[J].天然产物研究与开发，2010，22（6）：1012-1014.

[4] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].一部.北京：中国医药科技出版社，2010.

[5] 余正文，王伯初，杨占南，等.高效液相色谱法同时测定青蒿中东莨菪内酯、猫眼草酚及猫眼草黄素[J].中国酿造，2011（9）：175-178.

[6] 谭 亮，张 琦，范旭航，等.高效液相色谱法同时测定旱芹中东莨菪内酯和滨蒿内酯含量[J].中南药学，2010，8（7）：503-506.

[7] 吴蜀瑶，李 敏，王佳黎.HPLC测定青蒿植株不同部位的东莨菪内酯含量[J].中国现代中药，2010，12（6）：20-22.

[8] 孙洪章，卢静华，文 婧，等.RP-HPLC法同时测定丁公藤中东莨菪苷、东莨菪内酯及绿原酸[J].中成药，2014，36（9）：1906-1901.

[9] 张智超，刘玉强，才 谦.无梗五加果实中东莨菪内酯和东莨菪内酯苷测定研究[J].中成药，2013，35（7）：1508-1511.

[10] 谭建宁，张赟赟.RP-HPLC测定丁公藤中东莨菪内酯的含量[J].中国现代中药，2008，10（6）：35-36.