高效液相色谱技术在四环素类抗生素分析中的应用

2016-12-08丁会敏

化学工程师 2016年11期

关键词：类抗生素检测器色谱法

杨　光，陈　松，周　扬，丁会敏

（黑龙省能源环境研究院，黑龙江哈尔滨150027）

高效液相色谱技术在四环素类抗生素分析中的应用

杨光，陈松，周扬，丁会敏

（黑龙省能源环境研究院，黑龙江哈尔滨150027）

四环素类抗生素的大量生产及过量使用引起了食品安全、环境污染等问题，环境样品中四环素类抗生素的分析检测在药物分析、食品分析和环境分析等领域中的研究十分重要。高效液相色谱法以其灵敏度高、选择性强、应用范围广等特点成为了检验痕量抗生素的主要方法。本文综述了含有残留四环素类抗生素的食品、土壤、水等中环境样品前处理方法及其采用高效液相色谱法检测方法的研究进展,并对这一领域可能的发展方向进行了展望。

高效液相色谱法；四环素类抗生素；环境样品；前处理技术

随着畜禽、水产养殖业的快速发展，我国抗生素的种类和用量也在日益增加。抗生素的大量生产及使用不仅引起了食品安全问题，而且所造成的环境污染问题也更加突出。其中四环素类抗生素（tetracycline antibiotics，TCs）由于具有水溶性好、化学性质稳定、治疗效果好等优点成为了人类、动物临床上被广泛使用的抗生素，包括土霉素（oxytetracycline，OTC）、四环素（tetracycline，TC）、金霉素（chlortetracycline，CTC）及强力霉素（doxycycline，DC）等，其结构都含有并四苯基苯骨架（如图1所示）。四环素类抗生素进入机体后，少部分经过代谢反应生成无活性的产物，大部分则以原形及活性代谢物残留在机体内或排到体外进入环境中，由此引发的一系列生态系统和人类健康的问题引起了人们的重视[1]。而这些问题的研究迫切需要可靠、准确的检测技术来监测食品、药品、生态环境、水产品等样品中四环素类抗生素的实际含量，这使得样品中残留四环素类抗生素的分析成为全球环境科学领域一大研究热点。

目前，四环素类抗生素的主要检测方法有高效液相色谱法、微生物法和分光光度法[4]，其中高效液相色谱法应用最为广泛。高效液相色谱（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）是上世纪中期发展起来的一种新型理化检测方法，该方法引入了气相色谱理论并采用了高压泵，高效固定相和高灵敏度检测器，因而具有分析速度快、分离效率高、灵敏度高和操作自动化等特点[5]。最常用的检测器有紫外检测器（UVD）、荧光检测器（FLD）和电化学检测器（ED）等。由于环境中四环素类抗生素的浓度相对较低且样品成分复杂，各国纷纷致力于高效液相色谱检测技术的创新与发展。随着技术的不断改进，光二极管阵列检测器（DAD）及液相色谱-质谱联用（HPLC-MS）等技术不断涌现。目前，高效液相色谱法已成为食品分析和环境监测等领域重要的化学分离分析手段，本文就国内外高效液相色谱法对四环素类抗生素的分析应用现状作一综述。

图1　四环素类抗生素结构式Fig.1Molecular structure of TCs

1　样品前处理技术

由于四环素类抗生素在动物组织、粪便、土壤等环境样品成分复杂、杂质多、待测物浓度低，样品基质分离纯化是准确检测抗生素残留量的前提。通常样品前处理步骤包括过滤、提取、提取液的净化等步骤，常用的净化方法为固相萃取法。四环素类抗生素都具有共同的基本母核氢化并四苯环结构（如图1），易与金属离子螯合且在弱酸性溶液中易发生差向异构化、易降解且在生物样品中易与蛋白质形成共轭物[6]。因此，在固相萃取法中，对于不同的环境样品通常采用适当的提取液、洗脱液将抗生素萃取出来。

图2　TCs测定的样品前处理步骤Fig.2Scheme of the sample pretreatment procedures applied to the determination of TCs

林玲等人研究了HClO4、甲醇及McllVaine-EDTA溶液对猪肝中四环素类抗生素的提取效果的影响。用HClO4作提取液时，虽然可以沉淀样品中的蛋白，减少基质干扰，但它可将抗生素氧化，且对测试设备有腐蚀性。虽然四环素族抗生素在甲醇中的溶解度比较大，但甲醇的提取效率较低。McIlVaine-EDTA溶液综合了上述两种提取液的优势，不但提取效果良好而且回收率高。陆龙也采取甲醇-磷酸二氢钠缓冲液作为提取液来提取猪肉重的土霉素及四环素。而辛丹敏采用乙酸乙酷、草酸及乙腈对动物组织中四环素类抗生素提取时发现，乙腈沸点高，提取液浓缩耗时长，不利于抗生素药物的提取。先用乙酸乙醋提取，再用经典的高氯酸-正己烷来净化样品时，提取效果最好，还可以将氯霉素抗生素提取出来。由于四环素类抗生素在肉样品中易于蛋白质结合，因此，需用强酸或强碱性脱蛋白剂从生物样品中提取，而在pH值小于2.0的酸性条件下四环素类抗生素降解为脱水产物，加热时又可转变为差向异构体，葛云芝等人采用超声波法利用20%的三氯乙酸来沉淀蛋白质，提取效果更为理想。

对于牛奶样品来说，其中含有的钙镁离子易与四环素类药物分子中的酚羟基和烯醇基结合形成难溶的盐类。为解决这一问题，韩宝武等[7]采用酸性的Na2EDTA-McIlvaine溶液作为提取液，不但抵抗了四环素类抗生素与金属离子的结合，同时保证其稳定性并使回收率提高。杨玉霞也采用Na2EDTA-McIlvaine溶液提取食品中4种抗生素。

在粪便或土壤样品中通常含有一定的金属离子，易与四环素类抗生素形成螯合物，增加了目标化合物的提取难度。钟冬莲[6]比较了不同提取液对猪粪和鸡粪中残留抗生素提取效果的影响。发现提取猪粪中四环素类抗生素时，EDTA-McIlvaine缓冲溶液和甲醇-乙酸-水提取效果相当，但提取鸡粪中四环素的抗生素时，由于Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液可以将同金属离子螯合的抗生素提取出来，所以该缓冲溶液提取效果更好。由于丙酮的挥发性明显强于甲醇，且极性比甲醇弱，对腐植酸的溶解性也较小，向Na2EDTA-McIlvaine缓冲溶液中加入甲醇或者丙酮都可以显著提高土壤中OTC、TC和CTC的回收率[8]。故在提取液中加入等体积丙酮（含20%的0.01mol·L-1草酸甲醇）的缓冲溶液提取猪粪和鸡粪中的TCs且效果良好。

要对水样中目标分析物进行样品前处理，要先过滤除去悬浮物，水样品类似于粪便或土壤样品，要采用Na2EDTA溶液进行抗生素的提取。如图2所示，固相萃取法进行样品前处理过程中，洗脱这一过程至关重要。对水样中四环素类和喹诺酮类抗生素进行洗脱时采用甲醇为洗脱溶剂且洗脱剂用量大于50mL时，目标抗生素即可被完全洗脱[9]。陈猛等采用固相萃取法对河水与海水中的农药进行萃取，比较了乙腈、乙酸乙酯和正己烷-丙酮的洗脱效果，发现乙腈洗脱液的基底干扰较大，10mL丙酮-正己烷与10mL乙酸乙酯的组合洗脱较为理想，回收率高且干扰小。

综上所述，在固相萃取法中，针对不同的环境样品，选择适合的提取液、洗脱液有利于四环素类抗生素的萃取，常用的提取液如McIlvaine缓冲液等[3]。对于多数样品而言，四环素类抗生素通常以痕量存在，而样品本身又很复杂，有时要根据具体的样品基质选择适合的提取方法或结合多种方法达到净化目的[10]。这一步骤正是液相色谱法准确分析环境样品中四环素类抗生素的前提。

2　环境样品分析

2.1食物样品分析

采用液相色谱法对环境样品分析时可根据样品的实际情况采用合适的检测器（如紫外可见检测器、荧光检测器等）及设置最佳流动相流速、柱温、进样量等参数。增加流动相流速使分析时间减少，但流速过高会影响分离效果且降低谱柱的使用寿命。因此，流速选择不宜过高。一般情况下，提高色谱柱温度可使柱效增加，但温度过高时，容易产生气泡导致峰形变差，降低信噪比，并且会导致方法重复性差。而进样量的多少主要取决于色谱柱的样品容量，进样量的设定一般不能超过色谱柱的线性容量且高浓度的进样会导致色谱和质谱峰形变差[5]。

随着液相色谱技术的不断发展，涌现出的液相色谱-质谱联用技术可准确定性、定量测定复杂混合物的组分。该方法结合了液相色谱对复杂基体化合物的高分离能力和质谱独特的选择性、灵敏度、相对分子质量及结构信息于一体，因此，广泛应用于食品、生物、医药等行业。王覃[11]通过对海产品、畜禽肌肉和内脏组织中的3种四环素类抗生素的残留量的分析，对比了HPLC-MS/MS和HPLC-UVD两种分析技术。HPLC-MS/MS方法的检测限（3倍信噪比）为0.05～0.16ng·g-1，而HPLC-UVD方法的检测限（3倍信噪比）却为11～32ng·g-1，HPLC-ESI/MS/MS方法更适用于复杂动物组织基体样品中四环素类抗生素的残留分析，具有较高可靠性。

Ádám Tölgyesi等人[12]在检测猪肉中5种四环素类抗生素的含量并将HPLC-DAD（二极管列阵检测器）和HPLC-MS两种技术进行对比，发现这两种技术都显示良好的敏感性及选择性。对于加料试样来说，LC-MS/MS技术具有更高的准确度。而对于生物样品来说，HPLC-DAD技术则有更高的准确度，尽管LC-UV技术不能满足所有的测试要求，但由于该方法对于生产样品具有高准确度，因此，可适用于检测该类产品。与HPLC-MS/MS相比，采用同位素稀释法的HPLC-DAD在未来的分析测试中将更有优势。

虽然高效液相色谱法具有灵敏度高、检出率高等优点，但该方法不但对对样品前处理要求较高，而流动相的选择也直接影响峰形及出峰时间。在动物组织中，由于四环素容易与金属离子形成螯合物并吸附在反相色谱柱的硅醇基上。为了避免上述问题，林玲[7]等人改进了庞国芳等人[13]的测试方法，采用二极管阵列检测器并将磷酸、草酸、EDTA等酸性物质加入到流动相中，用乙腈-NaH2PO4溶液作为流动相取代了原有流动相乙腈-甲醇-草酸溶液。在pH值为2.5时，色谱峰的分离效果最好，适于畜禽组织中四环素族类抗生素的检测。韩宝武等人[7]对牛奶样品中四环素类抗生素进行检测时发现四环素类化合物主要以阳离子形式存在，草酸根可与其形成离子对，避免拖尾现象。草酸的浓度在0.01～0.08mol·L-1范围内峰形和分离效果基本相似，浓度为0.01mol·L-1时，保留时间最短。因此，选择甲醇-乙腈-草酸的混合溶液作为流动相并且该方法在十分钟内分离检测3种四环素类抗生素。表1总结了食物样品中TCs的测定方法、目标化合物、样品类型及主要实验条件。

2.2土壤及粪便样品

近年来，随着我国畜禽养殖业的迅速发展，产生了大量的畜禽粪便，四环素类抗生素作为饲料添加剂广泛用于畜禽养殖业，但其超量使用导致畜禽粪便及土壤中含高浓度抗生素，给环境带来了巨大的潜在危害[24]。因此，国内开展了对粪便及土壤中四环素类抗生素的分析研究（表2）。

张志强[8]采用高效液相色谱法对土壤及畜禽粪肥中OTC、TC、CTC 3种四环素类抗生素进行检测。若流动相中不含甲醇，OTC和TC不能基线分离；乙腈和甲醇同时做有机相且比例相同时，3种抗生素分离效果较好，但响应值较低。最终选用0.01mol· L-1草酸溶液-乙腈-甲醇（体积比为76∶16∶8）等度洗脱，土壤样品中的所有成分可在12min内能够全部洗出。而畜禽粪便样品由于成分更加复杂，采用同样方式洗脱，目标组分虽然在12min内全部出现，但在进样30min后仍有杂质峰不断出现。因此，需要梯度洗脱来提高流动相对非极性成分的洗脱能力并加快色谱柱的清洗。

乙酸和甲酸作为流动相时，分析物的峰形较好，但是梯度洗脱时，乙酸作为流动相时色谱图的基线随流动相比例的变化出现较大的波动，因此选择甲酸作为流动相。当流动相pH值大于3时，3种四环素类抗生素峰形变宽，峰高变小，保留时间延长，同时过低的pH值会降低色谱柱的寿命，因而流动相的pH值控制在2～3之间。钟冬莲等人[6]以0.3%甲酸水溶液（pH=2.6）作为流动相时，3种四环素类抗生素分离度最大，峰形对称且尖锐。因此选用0.3%甲酸水溶液作为流动相。其他粪便样品分析见表2。

2.3水样品

近几年来，国内外水环境中也有相继出现关于四环素类抗生素药物残留的报道[29]。HuanYu等人[14]采用超高效液相色谱法对地表水中6种四环素类抗生素（OTC、TC、DC、DMCTC、CTC、MINO）及差向四环素进行了分析。首先采用Oasis HLB萃取柱对地表水中抗生素进行固相萃取，其次采用超高液相色谱仪分别串联FLD（荧光检测器）及MS/MS（二级质谱）两种检测分别对TCs进行分析。由于超高效液相色谱法使用的有机溶剂更少[37]，因此，与液相色谱法相比，该方法更环保。两种检测器在以Waters ACQUITY UPLC BEH C8及ACQUITY CSH C18为色谱柱的条件下对待测物进行分离，运行时间分别为8.5及6.0min，与DekunHou及AiJia等人[30,31]报道的相比，极大地缩短了测试过程的运行时间。UHPLC-FLD的检测限低至0.2ng·mL-1而MS检测器的灵敏度是FLD的70倍且检测限低达0.003ng· mL-1。对于四环素类抗生素的分析来说，这是目前所报道的最低检测限。表3给出了部分水样品检测方法，其中UHPLC-MS/MS是目前公认的测量环境水样中四环素类抗生素的最佳方法。

3　结论及展望

高效液相色谱法被广泛地应用于食品、药品、土壤等环境中四环素类抗生素的检验。HPLC-MS联用技术的出现更是抗生素的分析具有高灵敏度及高选择性，形成了较准确、精准的现代分析技术，但鉴定未知物的能力还有待于提高。由于环境样品复杂，在采用高效液相色谱法前需对样品进行萃取，常用的萃取技术步骤复杂，因此，科学工作者会更加重视步骤单一、操作简单的萃取技术的研究。目前国内液相色谱法主要用于测定已知的目标化合物，缺少对于代谢物及转运产物的基础分析研究。在实际的生产生活中，在线监测技术更适用于对环境样品中残留抗生素的分析，我们还需进一步研究在线技术，如在线萃取及在线检测等技术[35]。随着科学技术的不断发展，高效液相色谱法及与其他仪器联用技术必将在生命科学、食品科学和环境监测等领域展现更好的应用前景。

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（后附表1～3）

Determination of persistent tetracycline residues by high performance liquid chromatography

YANG Guang，CHEN Song，ZHOU Yang，DING Hui-min
（Energy and Environmental Research Institute of Heilongjiang Province,Harbin 150027，China）

The problems of food safety and environmental pollution were caused by the large production and extensively application of tetracyclines（TCs）antibiotics.Hence,the determination of tetracycline residues in environmental samples were significant in the field of pharmaceutical analysis,food analysis and environmental analysis.High Performance Liquid Chromatography（HPLC）showed good sensitivity,high selectivity and wide application,which has become the main method to detect the trace TCs.In this paper,we provided an overview of the sample（such as soils,food and water samples）preparation and determination of TCs by HPLC.In addition,further developing trends were also discussed.

high performance liquid chromatography；tetracycline antibiotics；environmental samples；sample preparation