全自动核酸分子杂交平台在HPV基因分型中的临床应用

马秋林

(广东省东莞市妇幼保健院 523002)



·临床研究·

全自动核酸分子杂交平台在HPV基因分型中的临床应用

马秋林

(广东省东莞市妇幼保健院 523002)

目的 探索使用全自动核酸分子杂交平台进行人乳头瘤病毒(HPV)基因分型检测。方法 与传统反向斑点杂交(RDB)方法进行试验对比分析。结果 全自动核酸分子杂交平台与传统RDB方法检测HPV分型结果一致，试验结果的各项指标达到要求。结论 全自动核酸分子杂交平台自动化程度高、准确、无交叉污染，可以推广应用于HPV基因分型检测。

反向斑点杂交； 人乳头瘤病毒； 全自动

人乳头瘤病毒(HPV)检测有助于宫颈癌早期筛查及诊断、治疗，目前已发现有100余种亚型，其中近一半可以感染生殖器。根据HPV感染与宫颈癌的密切程度，可将其分为高危型和低危型，低危型HPV(6、11、42、43 和44型)等感染常引起寻常疣或肛门生殖器尖锐湿疣，以及低度宫颈上皮内病变(CINⅠ)，一般不诱发癌变；而高危型HPV(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56 和58型)等感染常可导致细胞周期调控失常，发生高度宫颈上皮内病变(CINⅡ、CINⅢ)及癌变，所以有必要进行HPV基因分型。对于HPV分型的检测方法，现采用最多的实验室方法为反向斑点杂交(RDB)，基于聚合酶链反应(PCR)-等位特异性寡核苷酸杂交(ASO)技术发展而来[1]，具有灵敏性高(可达103U/mL)[2]、准确性高、经济、通量大、易于推广等优点，被广泛用于基因分型、病原体检测、肿瘤研究等。基于RDB本身需要杂交、洗膜、显色等过程，且上述过程都需要手工完成，存在操作步骤繁琐、时间长、效率低等缺点。本文旨探讨通过对传统RDB方法进行改进，减少人工操作，使用全自动核酸分子杂交平台对HPV基因分型检测，简化流程、提高通量、提高工作效率，对HPV分型检测的推广意义重大。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本院2015年5～9月门诊妇产科HPV分型检测样本526例。

1.2 仪器与试剂 试剂采用深圳亚能HPV基因分型(23型)检测试剂盒及配套DNA提取试剂、辅助试剂(SDS、SSC、柠檬酸钠、POD、H2O2、TMB)等。采用广州洁特15 mL杂交管和50 mL杂交管，江苏康健吸嘴和1.5 mL离心管等。仪器采用深圳亚能生物全自动核酸分子杂交平台、美国UVP HB1000杂交炉、美国ABI 9700扩增仪、德国EPPENDORF 5810R离心机、美国THERMO 1389生物安全柜等设备。

1.3 方法

1.3.1 标本采集 以专用宫颈脱落细胞采集器进行采样，标本采集后尽快送检或放入2～8 ℃保存备检。对普通526例样本进行盲测，不作筛选，有利于阴性结果和阳性结果的对比分析。

1.3.2 样本处理 充分洗脱宫颈刷后，取1 mL液体转移到1.5 mL离心管中，13 000 r/min 离心10 min，弃上清液，保管留管底的细胞沉淀。再加入100 μL裂解液悬浮沉淀，放到干式恒温加热器上加热10 min，随后13 000 r/min离心10 min，保留上清液待用。

1.3.3 PCR扩增 每个样本对应取出2个反应液管，低速离心，在管盖上做好标记，然后分别加入已提取的待测样本DNA 5 μL，阴性质控品和阳性质控品随样本相同处理，加样量均为5 μL，反应总体系为25 μL，低速离心。扩增条件如下：95 ℃变性10 min，94 ℃ 10 s、42 ℃ 90 s、72 ℃ 30 s，10个循环，94 ℃ 10 s、46 ℃ 60 s、72 ℃ 20 s，30个循环，72 ℃ 5 min。

1.3.4 试剂配制 A液：100 mL 20×SSC，10 mL 10%SDS加纯水定容至1 000 mL，常温保存。B液：25 mL 20×SSC，10 mL 10%SDS加纯水定容至1 000 mL，常温保存。C液：100 mL 1 mol/L柠檬酸钠加纯水定容至1 000 mL，常温保存。孵育液，A液：POD=2 000∶1。显色液，19 mL C液加入1 mL TMB和2 μL 30%H2O2。

1.3.5 杂交、洗膜、显色操作 传统RDB方法。取15 mL塑料离心管，放入标有样本编号的膜条(应在膜条编号处用中性笔标记)，加入A液5 mL及所有对应的PCR产物，将离心管盖拧紧，再稍微拧松，以避免加热时管盖爆开。将离心管放入沸水浴中加热10 min(确保杂交液液面完全位于沸水浴液面下)，取出拧紧离心管盖，放入杂交仪51 ℃杂交2 h。取50 mL杂交管，加入45 mL B液于杂交炉中预热至51 ℃，阴性质控和阳性质控相同处理。准备装有B液的盒子。取出膜条，放入此盒中涮洗一下(每200 mL B液涮洗30张膜条)，然后转移至装有预热B液的50 mL离心管中，于51 ℃轻摇洗涤5 min。膜条放入孵育盒中室温轻摇浸泡30 min，弃去孵育液。用A液室温轻摇洗涤2次，每次5 min。用C液室温洗涤1～2次，同时配制显色液。将膜条浸泡于显色液中避光显色30 min，然后将膜条转移至去离子水中浸泡即可观察结果。

全自动核酸分子杂交平台。产物变性：将PCR产物置于95 ℃预变性10 min后，立即转入冰水混合物中放置5 min，置于2～8 ℃冰箱备用。(1)试剂准备：按照A液1 000 mL/次、C液300 mL/次、纯水300 mL/次、B液(5n+100)mL/次配置试剂。(2)试剂准备：准确加入POD(2.5n+10)μL于孵育液盒中。(3)杂交盒准备：将杂交盒置于加热槽中，为保证硅胶膜平衡，每个加热槽均应放置杂交盒。(4)膜条准备：在膜条上写好样本编号，严格按照仪器加液顺序将膜条加入杂交盒中。(5)运行程序：打开仪器，点击“样本数”右侧数字，输入样本数，然后点击“开始杂交”，程序开始运行。(6)加入PCR产物：报警提示后，根据膜条顺序依次加入PCR产物，然后盖上硅胶膜和盖板，点击“PCR确认”，仪器自动完成杂交过程。(7)添加显色液：报警提示后，配置显色液，点击“显色液确认”，仪器自动完成显色并注入纯水终止显色。(8)结果判读：报警提示后，点击“排水确认”完成排水后，点击“试验完成”，揭开盖板及硅胶膜，取出膜条保存并判读试验结果。

1.4 统计学处理 采用SPSS22.0,采用χ2检验对2种方法检测HPV分型结果进行比较，以P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

根据出现蓝色的斑点进行结果判读，526例样本，传统RDB方法检测阳性82例(阳性率为15.5%)，阴性444例；全自动杂交平台检测阳性82例(阳性率为15.5%)，阴性444例，两者差异无统计学意义(P>0.05)。两者一致性较好，符合率100%，检测结果一致，背景好，未发现有非特异性扩增点，多重感染斑点一致。见图1、表1。

表1 2种方法结果统计

图1 2种方法检测结果

3 讨 论

RDB法利用生物素等标记的探针和特异性扩增PCR产物(靶DNA序列)杂交，先将待用探针分别点到硝酸纤维素膜或尼龙膜上，再将待测DNA样本(一般为经PCR特异性扩增的产物，在PCR引物5′端预先进行生物素标记，使扩增产物相应标记有生物素)与之杂交，使待检样本与具有同源序列的探针结合，经洗涤去除未结合的DNA样本。由于待测DNA样本具有生物素类标志物，结合了待测DNA的探针点上同样带有生物素类标志物，再经相应显色反应后即可显出杂交信号。该技术较正向斑点杂交和凝胶电泳印迹转移杂交有快速、简便、高敏感性、特异性强等特点，尤其在基因分型、基因突变检测和病原体检测方面有独特优势(比如珠蛋白生成障碍性贫血基因诊断和结核菌耐药基因检测)[3-4]。目前大部分医疗机构HPV分型检测基于RDB方法，已有研究表明PCR-RDB法对HPV基因分型能提升宫颈癌的早期诊断价值[5]。此方法准确、操作简便，但也存在通量小，人为因素干扰多等缺点。使用全自动核酸分子杂交系统代替传统手工操作，可避免人为干扰，保证同一批次检测样本的试验均一性、试验结果的准确性和稳定性，也减轻了操作人员的负担，符合检验项目自动化发展方向，值得推广应用。

[1]林炳生,张太松,胥顺,等.改进的反向斑点杂交方法[J].分子诊断与治疗杂志，2011,3(1):18-21.

[2]张太松,董瑞华,李建芳,等.反向斑点杂交技术检测HBV YMDD基序变异的应用和评价[J].中山大学学报(医学科学版),2009,30(4):428-432.

[3]张银辉,张允奇,黄烈,等.地中海贫血诊断实验的选择在临床的应用价值[J].中华全科医学,2011,9(3):454-456.

[4]何敏,万逢洁,周凌云,等.反向杂交膜片检测结核菌耐利福平基因突变[J].中国公共卫生,2005,21(12):1420-1422.

[5]肖琳,赵帅.PCR反向点杂交法检测人乳头瘤病毒分型在确定早期宫颈癌中的价值[J].中外医学研究,2014,12(33):5-6.

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.21.048

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1673-4130(2016)21-3065-03

2016-03-21

2016-05-28)