微贮玉米秸秆对羊瘤胃液中挥发性脂肪酸含量的影响

任淑月，郝庆红，郭云霞，*，汤群，张英杰，刘月琴

（1.河北农业大学生命科学学院，河北保定071001；2.河北农业大学动物科技学院，河北保定071001）

添加剂

微贮玉米秸秆对羊瘤胃液中挥发性脂肪酸含量的影响

任淑月1，郝庆红1，郭云霞1，2*，汤群1，张英杰2，刘月琴2

（1.河北农业大学生命科学学院，河北保定071001；2.河北农业大学动物科技学院，河北保定071001）

本研究旨在检测饲喂微贮玉米秸秆（0%、25%、50%、75%、100%）对羊瘤胃液中挥发性脂肪酸含量的影响。通过对样品进行离心过滤处理，选用2-乙基丁酸（2-EB）作为内标物，采用气-质联用法（Agilent HP-INNOWA色谱柱和FID检测器）测定样品中挥发性脂肪酸含量。结果表明，饲喂微贮玉米秸秆组总挥发性脂肪酸（VFA）含量增加，其中25%、50%、75%、100%饲喂组VFA分别比对照组增加了1.02%（P＞0.05）、4.28%（P＞0.05）、5.29%（P＜0.05）、0.16%（P＞0.05）。乙酸含量下降，其中25%、50%、75%、100%饲喂组分别下降了10.56（P＜0.05）、2.81%（P＞0.05）、7.83%（P＜0.05）、15.03%（P＜0.01）。除100%饲喂组外，丙酸含量上升，其中25%、50%、75%饲喂组分别提高了0.59%（P＞0.05）、2.01%（P＞0.05）、4.73%（P＞0.05）。结果表明，微贮玉米秸秆可以调节瘤胃的发酵功能。

气-质联用；挥发性脂肪酸；瘤胃液；微贮玉米秸秆

微贮玉米秸秆以微生物的增殖为基础，以降低秸秆中纤维素、木质素的含量为目的，可提高微贮后秸秆的适口性，促进消化吸收。反刍动物饲料中的碳水化合物在瘤胃中被降解为脂肪酸。脂肪酸是脂质的重要组成元件，在组织器官中表现一定的生物功能（李春燕等，2015）。脂肪酸中的部分碳链为1—6的有机酸，包括乙酸、丙酸、戊酸等，具有较强的挥发性，故称之为挥发性脂肪酸（VFA）。VFA在瘤胃内发酵产生，是厌氧消化过程的重要中间产物，它可提供反刍动物瘤胃消化吸收所需能量的75%左右（Bannink，2008；Van Houter，1996；Bergman，1990）。同时，VFA能为瘤胃微生物的生长与繁殖提供一个较为理想的酸性环境，利于瘤胃纤维素降解菌的增殖（经语佳等，2014）。另外，VFA可以提高血浆胃动素水平，从而促进胃排空，刺激胃蛋白酶、胰液分泌，刺激胆囊收缩等胃运动，影响瘤胃上皮吸收运转，增加动物采食量，促进生产性能的提高（杨春涛等，2015；Penner等，2009）。

本试验通过采用气-质联用法测定羊瘤胃液中的VFA含量，研究微贮玉米秸秆对瘤胃发酵功能的影响。

1　材料和方法

1.1试验处理以枯草芽孢杆菌（N-8和N-10）、解淀粉芽孢杆菌、酵母菌复合菌剂，按每吨秸秆加入3%的硫酸铵和100 g菌粉的添加量进行玉米秸秆发酵，发酵后微贮秸秆与青贮秸秆营养成分见表1。以不同比例的（0%、25%、50%、75%、100%）微贮玉米秸秆替代青贮玉米秸秆。

表1　微贮秸秆与青贮秸秆的营养成分比较%

1.2样品预处理取饲喂4 h后的羊瘤胃液，经四层纱布过滤，7500 r/min高速离心5 min，取上清。将上清液过0.22微孔滤膜，滤液备测。

1.3试验仪器及药品气相色谱仪（Agilent MSD-5975C）-质谱仪（Agilent GC-7890A型），自动进样器（Agilent 7683B Series）；色谱柱（Agilent HP-INNOWA：30 m×0.250 mm×0.25 μm）；检测器：FID检测器；乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、戊酸、异戊酸、己酸和2-乙基丁酸（内标）标准品。

1.4色谱条件载气N2（144.58LPa，总流量24 mL/min）；进样口温度250℃；MS四极杆温度150℃；离子源温度230℃；采用程序升温：初始温度100℃，时间3 min，以5℃/min的速率升温至150℃，运行13 min，再以30℃/min的速率升温至210℃；进样量为1 μL。

1.5标准曲线的绘制及样品测定准确移取70 μL乙酸、20 μL丙酸、2.5 μL异丁酸、20 μL丁酸、4 μL戊酸、7.5 μL 2-乙基丁酸、1 μL异戊酸、5 μL己酸，至于5 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得245 mmol/L（14.68 g/L）的乙酸，53.62 mmol/L（3.97 g/L）丙酸，43.52 mmol/L（3.83 g/L）正丁酸，5.40 mmol/L（0.475 g/）异丁酸，7.37 mmol/L（0.752 g/L）戊酸，2.08 mmol/L（0.183 g/L）异戊酸，11.79 mmol/L（1.38 g/L）2-乙基丁酸，7.5 mmol/L（0.93 g/L）己酸储备液。将标准液稀释2、4、8、16的比例，制备成系列标准溶液，绘制标准曲线，并利用内标法测定羊瘤胃液中乙酸、丙酸、丁酸等VFA的浓度。

2　结果与分析

2.1微贮秸秆的营养成分分析由表1可以看出，微贮秸秆与青贮秸秆比较，干物质、粗灰分、粗脂肪含量差异不显著（P＞0.05），而粗蛋白质含量因添加了无机氮差异显著（P＜0.05）。秸秆经微贮处理后，粗蛋白质含量提高了106.5%。NDF、ADF、CF的含量分别降低了58.60%（P＜0.05）、37.45%（P＜0.05）、20.8%（P＜0.05）。无机氮的残留为0.0025%，99.9%的无机氮通过菌体的生长而转化为有机氮。提高了秸秆的营养价值，降低了纤维素的含量。

2.2色谱分析条件选择

2.2.1色谱柱根据相似相容原理，试验中分离VFA时，对非极性柱和极性柱进行了比较，结果表明，与非极性柱相比，极性柱中的各组分分离效果好，峰型好。这和乙酸、丙酸、丁酸等VFA的极性较强是相符合的，故本试验中选择极性较强的聚乙二烯为固定相（Agilent HP-INNOWA）的毛细管柱。

2.2.2柱温的选择10个碳原子以下的脂肪酸大部分具有挥发性，但是它们的沸点是不同的，乙酸沸点为117.5℃，而己酸的沸点是205℃，故试验中对柱温条件进行了对比。在色谱分析中柱温的选择分为恒温和程序升温两种方式。本试验对两种方式的分离效果进行了对比，试验证明，程序升温分析的分离效果是明显优于恒温分析的。所以试验采用程序升温：初始温度100℃，时间3 min，以5℃/min的速率升温至150℃，运行10 min，再以30℃/min的速率升温至210℃，实现对VFA的良好分离。

2.2.3载气压力出峰时间随着载气压力的增加而缩短，压力过大就会导致各组分分离不完全，压力小则会延长分析时间，因此选择标准为即节省载气消耗又能缩短各组分的出峰时间。经试验确定了载气N2（144.58 LPa，总流量24 mL/min），进样口温度250℃；MS四极杆温度150℃；离子源温度230℃；可对VFA的组分进行快速分离。

2.3定性分析在程序升温条件下，对VFA的混合标样和经处理的羊瘤胃液上机进行了分析，混合标样结果如图1所示。乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、2-乙基丁酸、异戊酸、己酸的保留时间分别为4.635、6.154、6.700、7.887、10.117、10.540、12.305 min，羊瘤胃液中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、戊酸、异戊酸、己酸的保留时间见图2。分别为4.587、6.127、6.694、7.866、10.101、10.540、12.294 min。图1、图2相同组分的保留时间基本保持一致，不同组分之间相差较大，分离效果较好，说明在选择的测定条件下可以取得良好的分析效果。

图1　混合挥发性脂肪酸的标准色谱图

图2　样品色谱图

2.4标准曲线绘制将不同浓度的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸等系列标准溶液分别进样，进行分析，将相应的VFA标品浓度X和各自的色谱峰面积Y作标准曲线，结果如图3所示。相应的回归方程见表1。结果表明，各组分浓度（X）与内标色谱峰面积之比（Y）具有良好的线性关系。

图3　VFA的标准曲线

表1　VFA标准曲线方程

2.5回收率及精密度空白样品中加入两个不同浓度的乙酸、丙酸、丁酸、异丁酸、己酸、戊酸、异戊酸标准物质进行测定，回收率和重复性结果见表2。

表2　回收率及精密度试验

2.6羊瘤胃液中VFA检测采用上述方法，对羊瘤胃液中VFA含量进行分析，其中VFA中的乙酸、丙酸、丁酸含量随着饲喂量的增加而呈不同的变化趋势（表3）。与对照组相比，饲喂微贮玉米秸秆组总VFA含量增加，其中25%、50%、75%、100%饲喂组分别增加了1.02%（P＞0.05）、4.28%（P＞0.05）、5.29%（P＜0.05）、0.16%（P＞0.05）。乙酸含量下降，其中25%、50%、75%、100%饲喂组分别下降了10.56（P＜0.05）、2.81%（P＞0.05）、7.83%（P＜0.05）、15.03%（P＜0.01）。除100%饲喂组外，丙酸含量上升，其中25%、50%、75%饲喂组分别上升了0.59%（P＞0.05）、2.01%（P＞0.05）、4.73%（P＞0.05）。丁酸的含量呈显著上升，其中25%、50%、75%、100%饲喂组分别增加了59.69%（P＜0.01）、58.14%（P＜0.01）、56.49%（P＜0.01）、46.19%（P＜0.01）。异丁酸、戊酸均显著上升，己酸含量呈下降趋势。

3　讨论

利用GC-MC对羊瘤胃液样品过滤后直接上样，回收率为94.50%～98.95%，精密度为0.44%～ 1.90%，提高了试验结果的重现性，而且操作简单，以内标法进行定量分析，能够有效地消除载气流动、柱温变化等造成的误差，大大提高了测定的精确度。

反刍动物日粮类型即粗饲料的饲喂比例与挥发性脂肪酸的产生量相关。据报道，随着日粮中粗饲料比例的降低，VFA合成量增加，其中乙酸含量下降，丙酸含量则随之上升（Wanapat等2014；熊本海等，2002）。而乙酸大部分用于氧化供能，丙酸则被肝脏转变为体组织成分，用于生长、繁殖，另外丙酸产量与甲烷的产生量之间呈负相关，因此，丙酸含量上升可以减少生成甲烷的能量损失（Klieve等，2007）。丁酸经瘤网胃壁吸收后大部分转变成为的β-羟基丁酸是作为机体组织尤其是肌肉组织的能量来源，丁酸含量升高，表明微贮玉米秸秆能促进瘤胃内微生物的生长，加快碳水化合物的降解，促进营养物质的消化吸收。试验测定结果显示，饲喂不同比例的微贮玉米秸秆4 h后的瘤胃液中乙酸比例下降趋势增大，丙酸浓度升高趋势降低，从而导致乙酸/丙酸的比值降低，总挥发性脂肪酸的增加，促进了饲料的消化吸收利用率，这与华金玲等（2013）由不同精粗比（3∶7；4∶6；5∶5）日粮对瘤胃中挥发性脂肪酸影响的研究结果一致。VFA含量的变化与瘤胃内细菌的增殖相关，微贮玉米秸秆的饲喂可以调节瘤胃发酵功能，促进瘤胃纤维素降解菌的生长，提高VFA的产量。

表3　玉米微贮秸秆对瘤胃液中VFA的影响mmol/L

[1]华金玲，郭亮，王立克，等.不同精粗比日粮对黄淮白山羊瘤胃内环境的影响[J].中国兽医学报.2013，33（6）：913～917.

[2]经语佳，高健，郑亚洲.6种长链脂肪酸对瘤胃微生物体外发酵挥发性脂肪酸浓度的影响[J].动物营养学报.2014，26（1）：252～259.

[3]李春燕，张秀英，张燕华，等.优化气相色谱法测定小鼠血清和肝组织中脂肪酸的含量[J].中国兽医杂志.2015，51（7）：33～35.

[4]熊本海，卢德勋，张子仪.瘤胃乙酸与内酸摩尔比例改变对瘤胃发酵及血液指标影响[J].畜牧兽医学报，2002，33（6）：537～543.

[5]杨春涛，刁其玉，司丙文，等.挥发性脂肪酸在反刍动物瘤胃上皮吸收转运及调节作用[J].中国畜牧杂志.2015，51（7）：78～82.

[6]Bannink A，France J，Lopez S，et al.Modelling the implications of feeding strategy on rumen fermentation and functioning of the rumen wall[J].Animal Feed Science and Technology，2008，143（2）：3～26.

[7]Bergman E N.Energy contributions of volatile fatty acids from the gastrointestinal tract in various species[J].Physio Rev，1990，70（2）：567～590.

[8]Klieve A V，Ouwerkerk D.Comparative greenhouse gas emission from herbivores[C].Beijing：The processing of theⅦinternation alsymposium on the nutrition of herbivores，2007.

[9]Penner G B，Taniguchi M，Guan I I，et al.Effect of dietary forage to expression of genes related to volatile fatty acid absorption and metabolism in ruminal tissue[J].J Dairy Sci，2009，92（6）：2767～2781.

[10]Van Houtert M.Challenging the retinal of altering VFA ration in growing ruminates[J].Feed Mix.1996，4（1）：514～525.

[11]Wanapat M，Gunun P，Anantasook N，et al.Changes of rumen pH，fermentation and microbial population as influenced by different ratios of roughage（rice straw）to concentrate in dairy steers[J].Journal of Agricultural Science.2014，152：675～685.

The test was conducted to determine influence of fermented corn straw on the sheep rumen volatile fatty acids.After filtered，centrifuged，selecting 2-ethyl butyrate（2-EB）as an internal stander，measuring the sample by GC-MS equipped with a Agilent HP-INNOWA capillary and a FID.The results showed the total volatile fatty concentration were improved by microbial fermentation of corn straw，the 25%，50%，75%，100%group was increased by 1.02%（P＞0.05），4.28%（P＞0.05），5.29%（P＜0.05），0.16%（P＞0.05），the acetic acid concentration were lower by 10.56（P＜0.05），2.81%（P＞0.05），7.83%（P＜0.05），15.03%（P＜0.01），expect for the 100%group，the propionic acid concentration of 25%，50%，75%group were increased by 0.59%（P＞0.05），2.01%（P＞0.05），4.73%（P＞0.05）.The results indicated that the capability of rumen were regulated by microbial fermentation of corn straw.

GC-MS；volatile fatty acids；rumen liquor；fermented corn straw with microbial

S816.6

A

1004-3314（2016）18-0032-04

10.15906/j.cnki.cn11-2975/s.20161809

国家肉羊现代产业技术体系建设项目（CARS-39）；河北农业大学大学生创业创新训练项目（2015042）