万古霉素和利福平联用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性评价*

张寅英，李 晔

（嘉兴市妇幼保健院临床药学室，浙江314000）

万古霉素和利福平联用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的体外抗菌活性评价*

张寅英，李 晔

（嘉兴市妇幼保健院临床药学室，浙江314000）

目的 评价万古霉素与利福平对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的联合体外抗菌活性。方法 采用微量肉汤稀释法分别测定万古霉素和利福平对30株MRSA的最低抑菌浓度（MIC），考察两药单用对MRSA的抗菌活性；以测得的单药MIC为依据，采用棋盘法设计，测定并计算万古霉素和利福平联用对30株MRSA的部分抑菌浓度指数，考察两药联用对MRSA的抗菌活性。结果 30株MRSA对万古霉素和利福平的耐药率分别为3.3%、90.0%。两药联用后绝大部分表现为协同作用[86.7%（26/30）]，少部分为相加作用[13.3%（4/30）]，未见表现为无关及拮抗作用者。结论万古霉素和利福平单药对MRSA均表现为部分有效，两药联用后对MRSA的抗菌活性增强，以协同作用为主，临床治疗MRSA引起的严重感染可考虑根据药敏试验结果采用万古霉素和利福平联合用药方案。

甲氧西林抗药性； 葡萄球菌，金黄色； 万古霉素/药理学； 利福平/药理学

耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（methicillin-resistant staphlococcusaureus，MRSA）是金黄色葡萄球菌获得mecA基因后产生的高耐药性菌株[1]。自1961年首次检出以来MRSA在全球广泛传播，成为医院和社区获得性感染的重要致病菌[2-4]。目前的临床指南大多推荐万古霉素作为治疗MRSA感染的首选药物，但相关研究表明，已出现耐药性和与之相关的治疗失败[5]，迫使人们开始考虑抗MRSA感染的新策略。

利福平是英国MRSA感染防治指南[6]的推荐药物之一，但单用易产生耐药性[7]。已有文献报道，利福平与其他抗生素联用对治疗金黄色葡萄球菌引起的感染性心内膜炎及骨科内置物术后感染具有较好疗效[8]。本研究通过考察万古霉素与利福平对MRSA的单药和联用体外抗菌活性，探讨两药联用抗MRSA感染的可行性，为临床合理用药及减少细菌耐药性提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验菌株 30株受试MRSA菌株为本院2013~ 2014年临床分离株，分离方法参照《全国临床检验操作规程》（第3版）进行，并经头孢西丁纸片法鉴定为MRSA。标准质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC29213，购自中国药品生物制品检定所。

1.1.2 试剂 利福平及万古霉素标准品（中国药品生物制品检定所）、Muller-Hinton琼脂（北京三药科技公司）、Muller-Hinton肉汤（北京奥博星生物技术公司）、甲醇（北京化学试剂公司）等。

1.1.3 仪器 比浊仪（法国梅里埃公司）、96孔平板（海门申华试验器材公司）、电热恒温培养箱（上海一恒科学仪器公司）等。

1.2 方法 选取已分纯并过夜新鲜培养的MRSA菌落

4~5个接种于Muller-Hinton肉汤中，增菌6 h后菌液用Muller-Hinton肉汤以比浊仪校正浊度至0.5 Mac Farland，再用Muller-Hinton肉汤稀释至1.5×105cfu/mL。参照2013年版美国临床和实验室标准化协会标准中对制备抗菌药物贮备液所需的溶剂和稀释剂的规定，分别以无菌蒸馏水和甲醇/无菌蒸馏水为溶剂配制万古霉素和利福平贮备液，质量浓度分别为1 920.000、640.000 μg/mL。采用微量肉汤稀释法[9]测定抗菌药物最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）。将万古霉素和利福平以灭菌Muller-Hinton肉汤倍比稀释，质量浓度为0.063~512.000 μg/mL。将配好的不同质量浓度的2种药物按棋盘法设计，两两组合加入到96孔平板中，每种抗菌药物加入量为50μL，再在每孔中加入1.5×105cfu/mL菌液100 μL，加样完成后将平板置于微量震荡器上震荡3 min混匀，35℃条件下过夜培养。以无菌生长孔的最低药物浓度为该药对该株细菌的MIC，记录两药单用的MIC（MIC万古霉素单用、MIC利福平单用），并选择最佳组合效应时两药联用时各自的MIC（MIC万古霉素联用、MIC利福平联用），以计算部分抑制浓度（fraction inhibitory concentration，FIC）。FIC=（MIC万古霉素联用/ MIC万古霉素单用）+（MIC利福平联用/MIC利福平单用）。FIC判读标准：FIC≤0.5为协同作用；＞0.5～1.0为相加作用；＞1.0～2.0为无关作用；>2.0为拮抗作用。

2 结 果

2.1 万古霉素和利福平单用对MRSA的MIC及耐药性 万古霉素对MRSA的MIC范围较窄，MIC50、MIC90均明显小于利福平。且MRSA菌株对利福平严重耐药，耐药率为90.0%，见表1。

表1 万古霉素和利福平单用对MRSA的MIC及耐药性（n=30）

2.2 万古霉素和利福平联用对MRSA的MIC及FIC分布 两药联用后对MRSA的MIC与单用比较，呈整体下降趋势，见表2。FIC为0.160~1.000 μg/mL，中位FIC为0.460 μg/mL；绝大部分表现为协同作用[86.7%（26/30）]，少数为相加作用[13.3%（4/30）]，未见表现为无关及拮抗作用者。

表2 万古霉素和利福平联用对MRSA的MIC（n=30）

2.3 万古霉素、利福平单用和联用的累积抑菌百分率

万古霉素与利福平联用后与单用比较，累积抑菌率曲线明显左移，表明两药联用后抗菌作用相互增强，见图1。

图1 万古霉素、利福平单用和联用的累积抑菌百分率（n=30）

3 讨 论

MRSA是医院内感染的重要致病菌之一，其在金黄色葡萄球菌中的比例逐年攀升，由其导致的感染对人类健康和医疗事业构成严重威胁。几乎所有的MRSA均为多重耐药菌，对包括β-内酰胺类、碳青霉烯类、氟喹诺酮类、大环内酯类及氨基糖苷类等在内的绝大多数临床常用抗菌药物均表现为耐药。多肽类抗生素——万古霉素是有效治疗MRSA感染的可选择药物之一，能干扰革兰阳性菌细胞壁合成的最终阶段，即干扰粘肽末端D-Ala-D-Ala二肽整合到分裂细胞的细胞内而使细菌死亡。有研究发现，耐药菌中该二肽发生改变可使万古霉素失去作用靶位，从而表现为耐药[10]。单药抗MRSA感染的诸多局限性也使临床治疗面临极大挑战。

本研究测定的30株MRSA对利福平的耐药率为90.0%，略低于林德峰等[9]的研究结果，可能与不同地区对利福平的使用频率的差异有关，且利福平对30株MRSA的MIC呈两极分布现象，表现为极为敏感（MIC≤0.125 μg/mL）或严重耐药（MIC≥64.000 μg/mL），其原因可能与利福平单用极易产生耐药性有关[7]，故一般不推荐利福平单用治疗MRSA感染。而另一方面，30株MRSA对万古霉素的耐药率为3.3%，也警示临床万古霉素耐药菌株的出现已非个别现象。本研究体外药敏试验结果表明，单用万古霉素对30株MRSA的MIC90为2.000 μg/mL，而联用利福平后MIC90下降至0.250 μg/mL。单用利福平对30株MRSA的MIC90为64.000 μg/mL，而联用利福平后MIC90下降至16.000 μg/mL，提示万古霉素和利福平联用后对MRSA的体外抗菌活性较单用两药时明显提高。而万古霉素与利福平联用后与单用比较，累积抑菌率曲线明显左移，也表明两药联用后抗菌作用相互增强。从作用机制来看，万古霉素干扰细菌细胞壁合成，利福平则为抑制菌体多聚酶活性，阻止细菌mRNA的形成，从而阻断菌体蛋白质的合成。两药作用于细菌生长繁殖过程的不同阶段，可能是导致其联用抗菌作用增加的原因之一，但具体机制仍有待于进一步研究。临床对由MRSA所致的感染可根据药敏试验结果制定给药方案，结合病情和个体情况可考虑联用万古霉素和利福平进行治疗。

[1] MoneckeS，CoombsG，ShoreAC，etal.Afieldguidetopandemic，epidemic and sporadic clones of methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J]. PLoS One，2011，6（4）：e17936.

[2] Garza-González E，Dowzicky MJ.Changes in staphylococcus aureussusceptibility across Latin America between 2004 and 2010[J].Braz J Infect Dis，2013，17（1）：13-19.

[3] Lee BY，Singh A，David MZ，et al.The economic burden of communityassociated methicillin-resistant Staphylococcus aureus（CA-MRSA）[J]. Clin Microbiol Infect，2013，19（6）：528-536.

[4] Chen CJ，Huang YC.New epidemiology of Staphylococcus aureus infection in Asia[J].Clin Microbiol Infect，2014，20（7）：605-623.

[5] van Hal SJ，Fowler VG Jr.Is it time to replace vancomycin in the treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections?[J].Clin Infect Dis，2013，56（12）：1779-1788.

[6] Gould FK，Brindle R，Chadwick PR，et al.Guidelines（2008）for the prophylaxis and treatment of methicillin-resistant Staphylococcus aureus（MRSA）infections in the United Kingdom[J].J Antimicrob Chemother，2009，63（5）：849-861.

[7] Tang HJ，Chen CC，Cheng KC，et al.In vitro efficacies and resistance profiles of rifampin-based combination regimens for biofilm-embedded methicillin-resistant Staphylococcus aureus[J].Antimicrob Agents Chemother，2013，57（11）：5717-5720.

[8] 陈华燕，徐爱飞，周道政，等.利福平联合其他抗生素对骨科内置物术后感染常见致病菌的体外抗菌活性观察[J].山东医药，2013，53（36）：36-38.

[9] 林德峰，于旭红，白艳，等.米诺环素与利福平联用对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的抗菌活性[J].中国临床药理学杂志，2010，26（11）：813-816.

[10]Liu C，Bayer A，Cosgrove SE，et al.Clinical practice guidelines by the infectious diseases society of america for the treatment of methicillinresistant Staphylococcus aureus infections in adults and children[J].Clin Infect Dis，2011，52（3）：e18-55.

Evaluation on in vitro antibacterial activity of vancomycin combined with rifampin against MRSA*

Zhang Yinying，Li Ye
（Clinical Pharmacy Room，Jiaxing Municipal Maternity and Child Health Care Hospital，Jiaxing，Zhejiang 314000，China）

Objective To evaluate the in vitro antibacterial activity of combination of vancomycin and rifampin against methicillin-resistant staphylococcus aureus（MRSA）.Methods The minimal inhibitory concentration（MIC）of vancomycin and rifampin on 30 strains of MRSA was respectively detected by using the broth dilution method；with the detected single drug MIC as the basis，the fraction inhibitory concentration（FIC）of the combination of vancomycin plus rifampin against 30 strains of MRSA was detected by adopting the checkerboard design.The antibacterial activity of combination of these two drugs on MRSA was investigated.Results The resistant rate of 30 strains of MRSA to vancomycin and rifampin was 3.3%and 90%respectively.Most manifestations of 2-drug combined medication were the synergic action[86.7%（26/30）]and the minority were the additive action [13.3%（4/30）]，neither non-correlative nor antagonism action was seen.Conclusion Single vancomycin and rifampin to MRSA manifest the partial effect，after their combination，the antibacterial activity to MRSA is enhanced，which is mainly synergic action. Clinically treating severe infection caused by MRSA can adopt the combination scheme of vancomycin and rifampin according to the drug susceptibility test results.

Methicillin resistance； Staphylococcus aureus； Vancomycin/pharmacology； Rifampin/pharmacology

10.3969/j.issn.1009-5519.2016.22.002

A

1009-5519（2016）22-3423-03

2016-07-07）

浙江省嘉兴市科技局一般科技计划项目（2014AY21047）。

张寅英（1987-），硕士研究生，主要从事临床药学工作。