山苓祛斑凝胶剂提取物质量标准研究

陈 军 舒 祥 余南才

武汉市中西医结合医院药学部，湖北 武汉 430022



药物研究

山苓祛斑凝胶剂提取物质量标准研究

陈 军 舒 祥 余南才

武汉市中西医结合医院药学部，湖北 武汉 430022

目的：建立山苓祛斑凝胶的质量标准。方法：运用HPLC法测定祛斑凝胶提取物中尿囊素、阿魏酸含量作为评价指标，流动相分别为乙腈-0.085%磷酸-水(5∶95)、(17∶83)，流速为0.5mL/min、1mL/min，柱温30℃，检测波长为224nm、316nm。结果：尿囊素、阿魏酸线性范围0.368～2.208μg、0.424～2.544μg，精密度RSD0.55%、0.92%，稳定性RSD1.4%、1.5%，重复性RSD0.95%、0.55%。祛斑凝胶剂中尿囊素、阿魏酸含量分别为11.2mg/g、4.5mg/g。结论：该方法重复性好，质量可控，可为该凝胶制剂进行中试、生产提供参考。

山苓祛斑凝胶；含量测定；高效液相色谱法

黄褐斑也称“肝斑”、“蝴蝶斑”，为面部黄褐色色素沉着，且多对称蝶形分布于颊部，大小不一、形态不定，好发于育龄期女性[1]。黄褐斑由多种因素综合作用导致，其发病与妊娠、长期口服避孕药、月经紊乱有关，血中雌激素水平高是主要原因。目前，尚无彻底治愈方法，临床治疗方法有一定的副作用，如造成外源性褐黄病、皮肤萎缩、永久性脱色，甚至出现肾毒性、精神、神经症状等，因而黄褐斑一直是医学界关注的问题。中医药治疗黄褐斑有着悠久历史，具有一定优势。中药凝胶剂是一种新型外用制剂，适用于皮肤、黏膜及腔道，不仅避免口服给药存在的胃肠道内酶、酸等首过作用，而且可减轻药物不良反应，同时具有使用方便、舒适、生物相容性好等多种优点，临床上治疗黄褐斑已取得较好疗效[2-4]。复方中药山苓祛斑方为我院中医部周利副主任医师经验方，由山药、茯苓、白芷、白及、当归等药组成。研究以尿囊素、阿魏酸含量作为凝胶剂质量标准[5-6]，用HPLC法测定凝胶剂中尿囊素、阿魏酸含量，为其质量控制提供实验依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 DIONEX Ultimate 3000 型高效液相色谱仪(紫外DAD检测器，美国DIONEX公司)；CP 2104 电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。

1.2 材料 山药、茯苓、当归等9味中药材饮片(亳州国一堂中药饮片有限公司)，祛斑凝胶剂(批号：20150401、20150405、20150410，自制)；凝胶剂阴性样品(自制不含当归及山药的样品各一份，批号20150410)，尿囊素(批号：111501-200001)、阿魏酸对照品(批号：110773-200611)、茯苓(批号：121117-201302)、当归(批号：120927-201408)、山药(批号：121137-201405)等对照药材购于中检所，乙腈为色谱纯，其余试剂为分析纯。

2 方法

2.1 祛斑凝胶提取物中尿囊素含量测定

2.1.1 色谱条件 ODS C18色谱柱(Thermo-Scientific Syncronis, 250mm×4.6mm，5μm)；流动相：乙腈-0.085%磷酸水(5∶95)；流速：0.5mL/min；柱温：30℃；检测波长：224nm；进样量：10μL。

2.1.2 对照品溶液制备 精密称取尿囊素对照品9.2mg，置50mL量瓶中，用超纯水稀释至刻度。

2.1.3 供试品溶液制备 称取山苓祛斑凝胶提取物3g，加入适量甲醇超声溶解，加入100-200目硅胶4.5g，蒸干溶剂后进行硅胶柱色谱分离。硅胶用量为50g (300～400目)，洗脱剂选择二氯甲烷∶甲醇(9∶1)，收集200mL，浓缩后用甲醇稀释至10mL，作为供试品溶液。

2.1.4 阴性对照溶液制备 按处方量制备除山药外的所有组分的凝胶剂，作为山药阴性对照样品，余同“2.1.3”操作，即得。

2.1.5 线性关系考察 分别进样2、4、6、8、10、12μL以尿囊素含量为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准曲线，进行线性回归，得回归方程y=9.0814x+0.0354，R2=0.9998，表明尿囊素在0.368～2.208μg线性关系良好。2.1.6 精密度试验 精密吸取供试品溶液10μL，连续进样6次，记录峰面积积分值，结果表明：精密度良好，平均峰面积为15.5925，RSD为0.55%。

2.1.7 稳定性试验 精密吸取尿囊素标准品溶液10μL，按0、4h、8h、12h、16h、24h 进样1次，记录峰面积积分值，结果表明：尿囊素标准品稳定性良好，RSD为1.4%。

2.1.8 重复性试验 取同一批凝胶剂6份，按尿囊素供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.1.1”色谱条件进样6次，计算尿囊素平均含量为4.5mg/g，RSD为0.95%，表明该方法重复性良好。

2.1.9 加样回收率试验 称取山苓祛斑凝胶提取物1.5g，分别加入尿囊素对照品溶液15μL，按照供试品溶液制备的方法处理，进样10μL，记录峰面积积分值，代入回归方程，计算尿囊素标准品的加样回收率为97.2%，RSD为1.2%。

2.1.10 尿囊素含量测定 精密吸取供试品溶液10μL，液相色谱仪，记录峰面积积分值，代入回归方程，计算得出尿囊素含量为4.5mg/g。

2.2 山苓祛斑凝胶提取物中阿魏酸含量测定

2.2.1 色谱条件 ODS C18色谱柱(Thermo-Scientific Syncronis, 250mm×4.6 mm，5μm)；流动相：乙腈-水(17:83)；流速：1mL/min；柱温：35℃；检测波长：316nm，进样量：10μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 精密称取阿魏酸对照品，加甲醇制备成浓度为0.212μg/μL的溶液。

2.2.3 供试品溶液的制备 取山苓祛斑凝胶提取物10g，加甲醇超声，并定容至50mL容量瓶中。

2.2.4 阴性对照溶液制备 按处方量制备除当归外的所有组分的凝胶剂，作为当归阴性对照样品，余同“2.2.3”操作，即得。

2.2.5 线性范围考察 分别精密吸取阿魏酸对照品溶液2、4、6、8、10、12μL注入液相色谱仪，测定峰面积，以峰面积和进样量求得回归方程y=1.2937x+0.3404,R2=0. 9996，表明在0.424～2.544μg有良好线性关系。

2.2.6 精密度实验 精密吸取对照品溶液10μL，重复进样6次，测得峰面积，其RSD为0.92%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验 精密吸取阿魏酸标准品溶液10μL，按0、4、8、12、16、24h 进样1次，记录峰面积积分值，结果表明：阿魏酸标准品稳定性良好，RSD为1.5%。

2.2.8 重复性试验 取同一批凝胶剂6份，按阿魏酸供试品制备方法制备供试品溶液，按“2.2.1”色谱条件进样6次，计算阿魏酸平均含量为11.4mg/g，RSD为0.55%，表明该方法重复性良好。2.2.9 加样回收率实验 精密量取两份1mL样品溶液：向其中一份精密添加阿魏酸对照品溶液，定容至50mL，测得平均回收率为96.8%，RSD为1.56%。

2.2.10 阿魏酸含量测定 精密吸取供试品溶液10μL，液相色谱仪，记录峰面积积分值，代入回归方程，计算得出阿魏酸含量为11.2mg/g。2.3 山苓祛斑凝胶剂TLC定性鉴别 按2015版《中国药典》一部及附录(0502)薄层色谱法对祛斑凝胶剂中山药、当归及茯苓进行TLC定性鉴别[7]，供试品色谱中，在与对照药材、对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点，阴性无干扰。

按文献[8]对山苓祛斑凝胶剂中的尿囊素进行薄层鉴定：取山苓祛斑凝胶剂10g，加入适量甲醇超声溶解，溶解后吸取10μL点于硅胶GF254板，以氯仿∶乙酸乙酯∶丙酮∶甲酸∶甲醇(1∶8∶1∶1∶2)为展开剂，15%的对二甲氨基苯甲醛的硫酸乙醇溶液为显色剂。供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同黄绿色斑点，且阴性样品无干扰。

3 讨论

3.1 波长选择 经紫外光谱扫描，测得尿囊素在224nm处有最大吸收，阿魏酸在316nm处有最大吸收，故本文分别选择224nm作为尿囊素的检测波长，316nm作为阿魏酸的检测波长。

3.2 流动相的选择 原有用甲醇-水(1∶9)测定尿囊素含量，实验发现其分离效果不好，分离度不能达到分析要求；甲醇-磷酸二氢钾缓冲液(2∶98)比例的极性太大，而纯水对色谱柱的损害较大。经摸索最后采用乙腈-0.085%磷酸-水(5∶95) 作为流动相，基本能够达到较好的分离效果，尿囊素出峰时间大约在5.5min左右。重复性试验RSD为0.95%，加样回收试验测得平均回收率为96.8%，RSD为1.56%也表明在此色谱条件下尿囊素的分离效果较为满意。

研究通过测定山苓凝胶剂中尿囊素和阿魏酸的含量，初步确定了山苓凝胶剂的质量控制方法。所建立的方法简单，准确，分离度与重现性均好，可以用于控制山苓凝胶剂的质量。

[1]康金森，王雪飞，刘发，等．红玉祛斑胶囊对黄褐斑模型小鼠的影响[J].中药药理与临床，2013,29(4):134-136．

[2]刘林，霍志斐，史树堂，等．茯苓多糖的药理作用概述[J].河北中医，2010,32(9):1427-1428．

[3]杨宏莉，李少春，张伟伟，等．山药多糖的药理作用[J].医学研究与教育，2010,27(3):80-82．

[4]樊靓，汤尚文，余海忠，等．山药中尿囊素研究进展[J].食品科学，2015,(3):308-308．

[5]王海波，蔡宝昌．反相高效液相色谱法测定不同产地山药中尿囊素的含量[J].中药新药与临床药理，2004,15(3):190-192．

[6]胡杰,冯丽莉,崔福德．当归川芎中阿魏酸提取的研究[J].时珍国医国药，2004,15(11):732-733．

[7]国家药典委员会．中华人民共和国药典(一部)[S]．北京：中国医药科技出版社，2015：57-58．

[8]凌育赵．淮山米粉中尿囊素的检测及提取工艺研究[J]．粮油食品科技，2005,13(3):45-51．

[9]周进，林世和，陈军，等．正交试验法优选祛斑凝胶的水提工艺[J].中医药导报，2015,21(9):58-59．

[10]郭红叶，匡颖，闫小平，等．祛斑凝胶剂质量标准[J].中国实验方剂学杂志，2014,20(14):45-47．

[11]刘芝兰,王娟,沈平，等．当归中阿魏酸的提取和纯化研究[J].高校化学工程学报，2007,21(6):1008-1012．

[12]赖宝林，王利胜，张升，等．中药凝胶剂的研究进展[J].中药新药与临床药理，2010,21(2):211-213．

(编辑：陶希睿)

Quality Standards Control of the Shanling Quban Gels

CHEN Jun SHU Xiang YU Nancai

Integrative Medicine Hospital of Wuhan City Department of Pharmacy，Wuhan 430022,China

Objective Study on establish quality standards of Shanling Quban gels. Methods The content of allantoin and ferulic acid was used as the index to optimize the extraction process by HPLC analysis. Results Allantoin and ferulic acid showed a good linear relationship in the range of 0.368～2.208μg, 0.424～2.544μg with an average recovery ofRSD1.4%, 1.5%，RepeatabilityRSD0.95%, 0.55%. and precision ofRSD0.55%, 0.92%, respectively．Average extracting amount of allantoin and ferulic acid in the Shanling Quban gels was 11.2mg/g and 4.5mg/g．Conclusion This method is simple and appropriate for quality control of Quban gels and provide a reference for industrial production of this preparation．

Shanling Quban gels；Content determination；HPLC

2016-08-17

陈军(1975-)，男，汉族，硕士研究生，主管中药师，研究方向为中药鉴定、中药药物分析、中药炮制。E-mail:10078474@qq.com

R284.1

A

1007-8517(2016)21-0011-03