高糖环境下不同浓度黄芩苷对人肾小管上皮细胞凋亡的影响

孙 韬 黄竹娟 苏 宁*

1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2. 广州市丰华生物工程有限公司，广东 广州 510730



高糖环境下不同浓度黄芩苷对人肾小管上皮细胞凋亡的影响

孙 韬1,2黄竹娟1苏 宁1*

1.广州中医药大学，广东 广州 510006；2. 广州市丰华生物工程有限公司，广东 广州 510730

目的：研究在高糖环境下不同浓度黄芩苷干预对人肾小管上皮细胞凋亡的影响。方法：本研究通过体外实验，分别检测在高糖环境下不同浓度黄芩苷干预24h、48h、72h 上皮细胞增殖及凋亡情况，并同时设立阴性对照组(低糖组)、阳性对照组(高糖组)和阳性药物对照组(RGZ)。结果：24h、48h时间点，黄芩苷干预下的上皮细胞以促进增殖、抑制凋亡为主要表现；72h时间点，低剂量黄芩苷(50、100μmol/L)干预下的上皮细胞仍以促进增殖、抑制凋亡为主要表现，但高剂量黄芩苷组别(200μmol/L)干预下的上皮细胞以抑制增殖、促进凋亡为主要表现。在高糖环境下黄芩苷可抑制上皮细胞凋亡，与阳性药物对照(RGZ)的趋势一致。结论：黄芩苷可能通过抑制细胞凋亡的药理作用，发挥对肾脏的保护作用。

黄芩苷；人肾小管上皮细胞(HK-2)；细胞凋亡；糖尿病

糖尿病肾病[1](diabetic nephropathy，DN)是以肾脏微血管病变作为最主要表现的糖尿病并发症，也是造成慢性肾衰的主要病因，发病机制尚不完全清楚。近年来，随着研究的深入，证实细胞凋亡参与DN发生机制。细胞凋亡是机体内细胞死亡的重要途径[2]，细胞的死亡和更新是多细胞生物整个生命过程中不可缺少的环节，可及时清除机体内的多余细胞和受损伤细胞，对各组织器官的发育及免疫系统的建立发挥重要作用。通常情况下，细胞凋亡过程受机体内严格调控，以维持整个生命过程中各组织器官的稳定性。但当细胞凋亡调控失衡时，可引起细胞过度增殖或过度凋亡，都是导致糖尿病肾病患者肾功能进一步恶化的重要因素之一。

传统药物黄芩(scutellaria baicalensis georgi)为唇形科植物黄芩的干燥根，迄今己有2000多年的药用历史，该药在《神农本草经》中列为中品，用于“诸热黄胆，肠泄痢，逐水，下血闭，恶疮疽蚀火疡”。黄芩苷(baicalin bai，BB)是从黄芩中提取的一种黄酮类化合物，具有抗菌、消炎、抗氧化、治疗或预防糖尿病及其并发症等药理作用[3]。在前期研究中发现黄芩苷对糖尿病肾病大鼠肾脏具有保护作用[4-8]。在此基础上，本文通过体外实验，观察在高糖环境下不同浓度的黄芩苷对人肾小管上皮细胞(HK-2)细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 主要实验材料 HK-2细胞株购自于中山大学实验动物中心，盐酸罗格列酮标准品、黄芩苷标准品(广东省食品药品检验所,批号20141201)，DMEM 低糖和高糖培养基、胰蛋白酶(上海立菲生物技术有限公司)，胎牛血清(FBS，浙江天杭生物科技有限公司)，噻唑蓝(MTT，美国sigma公司)、二甲基亚砜(DMSO，美国sigma公司)。

1.2 细胞培养及分组 HK-2细胞株置于体积分数为5%CO2的37℃恒温培养箱中用含10%FBS的DMEM低糖培养基传代培养，胰蛋白酶消化细胞后，用计数板计数，按以4000/孔的密度接种于96孔板，每孔加入100μL 含10%FBS的低糖培养液培养24h，使细胞同步于G0期。弃去培养液，将HK-2细胞随机分为7组(每组设5个复孔)：A组(NG)：DMEM 低糖培养液(D-葡萄糖浓度为5.5mmol/L)；B组(HG)：DMEM 高糖培养液(D-葡萄糖浓度为25mmol/L)；C组(HG+R5)：DMEM 高糖培养液和RGZ(终浓度为5μmol/L)；D组(HG+R10)：DMEM 高糖培养液和RGZ(终浓度为10μmol/L)；E组(HG+BB50)：DMEM 高糖培养液和BB(终浓度为50μmol/L)；F组(HG+BB100)：DMEM 高糖培养液和BB(终浓度为100μmol/L)；G组(HG+BB200)：DMEM 高糖培养液和BB(终浓度为200μmol/L)。分别干预24、48、72h，共设3个实验观察点。

1.3 MTT比色法检测细胞增殖 当实验点结束(24、48、72h)时，使用浓度为5mg/mL的MTT溶液加入待测孔，孵育4h，弃去废液，重新加入DMSO 150μL /孔，振荡10min后，放入iMark 吸收光酶标仪(选择490nm波长，Bio-Rad 公司)进行检测并记录结果(OD值)。1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率 采用AnnexinV-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)双标记染色法检测细胞凋亡情况。按上述分组方法，以4000/孔的密度将细胞培养于96孔板中，当实验点结束(24、48、72 h)时，用流式细胞仪检测各组肾小管上皮细胞的凋亡率(Q2+Q4)。

2 实验结果

2.1 高糖环境下不同浓度黄芩苷对HK-2细胞增殖的影响 在24h的实验点中，B组、C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。F组与B组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其余组别与B组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。在48h的实验点中，B组、C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。B组、C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。在72h的实验点中，B组、C组、D组、E组和F组与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；其余组别与A组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。C组、D组和F组与B组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，其余组别与B组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。结果详见表1和图1。

2.2 高糖环境下不同浓度黄芩苷对HK-2细胞凋亡率的影响 在24h的实验点中，C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。在48h的实验点中， C组、D组、E组、F组和G组与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。在72h的实验点中，B组、C组、E组和与A组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)；D组、F组与A组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)。C组、D组、E组、F组和G组与B组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)。结果详见表2。

表1 高糖环境下不同浓度黄芩苷对HK-2细胞增殖的影响 (OD值)

注：与A组同时段比较，*P<0.05；与B组同时段比较，**P<0.05。

表2 高糖环境下不同浓度黄苓苷对HK-2细胞凋亡的影响 (%，Q2+Q4)

注：与A组同时段比较，*P<0.05；与B组同时段比较，**P<0.05。

3 讨论

MTT比色法是目前检测细胞增殖的常用手段之一，其主要原理[9]是利用四甲基偶氮唑盐在活细胞线粒体的琥珀酸脱氢酶作用下，由淡黄色被还原成蓝紫色或蓝黑色的MTT-甲肷，形成的量与活细胞代谢率及细胞增殖程度成正相关。在研究中观察到，在高糖环境下，HK-2细胞增殖快速(B组与A组比较)，低、中浓度黄芩苷影响下的HK-2细胞增殖快速，高浓度黄芩苷影响下的HK-2细胞增殖受抑制，72h观察时间点最为显著。提示高糖对HK-2细胞产生双重效应，既能诱导细胞增殖，在高浓度药物环境下，又可抑制细胞增殖。本实验使用的阳性对照组(RGZ)的HK-2细胞增殖情况与既往研究的报道[10]基本一致。

流式Annexin V/PI 双染法是目前比较常用、灵敏较高的细胞凋亡测定方法，其主要原理是通过Annexin V-FITC和PI双重荧光标记以区分正常细胞、早期凋亡细胞和坏死细胞。在研究中观察到，在高糖环境下，HK-2细胞凋亡显著增多(B组与A组比较)，结合MTT检测结果提示在高糖环境下HK-2呈高增殖伴高凋亡率。在药物(包括BB、RGZ)影响下，可显著降低凋亡率。但是高浓度黄芩苷(G组)在72h观察时间点的凋亡率较其他用药组别显著升高，结合MTT检测中低增殖的表现，考虑高浓度黄芩苷促进HK-2细胞凋亡，抑制HK-2细胞增殖，而低、中浓度黄芩苷抑制HK-2细胞凋亡、促进HK-2细胞增殖。

本研究结果与前期研究结果[4-8]提示黄芩苷可能通过抑制细胞凋亡的药理作用，发挥对肾脏的保护作用。

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[3]辛文妤,宋俊科,何国荣,等.黄芩素和黄芩苷的药理作用及机制研究进展[J].中国新药杂志,2013,22(6):647-653.

[4]赵碧玲,李先涛,潘思敏,等.黄芩苷胶囊对糖尿病肾病大鼠肾脏病理形态学和蛋白激酶C的影响[J].2016,11(4):488-491.

[5]苏宁,赵平,佘燕玲,等.黄芩苷对糖尿病肾病大鼠足细胞损伤的修复作用研究[J].中医学报,2011,26(7):803-805.

[6]苏宁,李丰,赵平,等.黄芩苷调节DN大鼠肾脏局部生物活性物质的实验研究[J].世界中西医结合杂志,2010(1):22-24.

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(编辑：穆丽华)

Effect of Baicalin Bai on HK-2 cells Apoptosis in High GLucose Medium

SUN Tao1,2HUANG Zhujuan1SU Ning1＊

1.Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou 510006, China；2. Guangzhou Fenghua Bioengineering Co., Ltd , Guangzhou 510730, China

Objective To study the effect of Baicalin Bai(BB) on HK-2 cells apoptosis in high glucose medium.Methods The cell proliferation was detemined with MTT method at 24h，48h，72h respectively after HK-2 cells were incubated with normal glucose, high glucose, high glucose plus RGZ or high glucose plus BB.Results At 24h & 48h，in comparison with NG & HG group，the proliferation of HK-2 cells in HG+BB group was increased insignificantly. At 72h，in comparison with NG group，the proliferation of HK-2 cells in HG+BB group was increased insignificantly except for the high - dose HG+BB group(200μmol/L).During the observation，the effect of BB on HK-2 cells growth cultured in high glucose medium is facilitative mainly, it′s similar to RGZ in concentration and times．Conclusion BB pharmacological effects by inhibiting apoptosis, play a protective effect on the kidneys.

HK-2；Kidney Tubules；Cell Division；High Glucose

2016-08-23

孙韬(1984-)，男，汉族，硕士研究生，主要研究方向为中医药防治代谢性疾病。E-mail:dick_hill@163.com

苏宁(1966-)，女，汉族，博士，教授，硕士研究生导师。主要从事中医药防治免疫相关性疾病的研究。E-mail:suning@gzucm.edu.cn

R285.5

A

1007-8517(2016)21-0029-03