食品中丙烯酰胺检测新技术研究进展

王紫梦 鲁 迨 石星波,2,3 邓洁红

(1.湖南农业大学食品科学与技术学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南农业大学东方科技学院，湖南 长沙 410128；3. 湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南 长沙 410082)



食品中丙烯酰胺检测新技术研究进展

王紫梦1鲁 迨1石星波1,2,3邓洁红1

(1.湖南农业大学食品科学与技术学院，湖南 长沙 410128；2. 湖南农业大学东方科技学院，湖南 长沙 410128；3. 湖南大学化学生物传感与计量学国家重点实验室，湖南 长沙 410082)

丙烯酰胺(AA)是一种食品热处理加工过程中产生的具有神经毒性与潜在致癌性的物质，已引起全世界范围的广泛关注。准确测定复杂食品体系中AA的含量，是评估其对人体危害的前提。文章评述了AA传统检测方法(液相色谱，气相色谱，液质联用和气质联用)的不足，主要体现在样品前处理过程复杂、需要必要的衍生化、分析仪器昂贵及需要专业技术人员操作等方面；并重点介绍了毛细管电泳法、酶联免疫吸附试验法、超分子识别法、纳米生物传感法等新型的检测方法的优缺点，及在实际应用中遇到的具体问题；同时，对未来检测方法的发展方向进行展望，旨在为更高效、实用检测方法的开发提供思路。

丙烯酰胺；检测；毛细管电泳法；酶联免疫吸附试验法；超分子识别法；纳米生物传感器

丙烯酰胺(acrylamide，AA)于1994年被国际癌症研究机构(International Agency for Research on Cancer，IARC)划分为“可能致癌物”[1]。2002年4月，瑞典国家食品机构和斯德哥尔摩大学的研究人员发现在油炸及焙烤的淀粉类热加工食品中存在大量的AA[2-3]，这一发现引起了全世界的关注。食品的热处理是现代食品加工过程中不可或缺的工序，富含碳水化合物的食物在热处理下发生美拉德反应，从而使其拥有特定的色、香、味。因此，加强食品中AA的浓度监测就显得尤为重要[4-6]。

准确定量分析食品中的AA，是准确评估这种化合物危害的前提。近年来，由于增加了AA对人类生物体诱变、致癌的影响以及其机制的了解[7-8]，开发新AA检测方法的目的不仅在于对痕量AA生物标志物的监测，还在于对其相关风险水平的判断[9]。目前，更多的研究[10-11]主要集中在改进现有的技术方法。而AA因其低分子量(71.08)、高极性、较好的水溶性(215.5 g/100 mL)、高反应活性以及复杂的食品基质，增加了定量食品中AA的难度[12]。因此，开发高灵敏、高选择性、能对抗富含干扰化合物和复杂基质样品的新型检测方法，具有一定的紧迫性与挑战性。

目前，AA的常用检测方法有气相色谱法(gas chromatography，GC)或气相—质谱联用(gas chromatography-mass spectrometry，GC—MS)，液相色谱法(liquid chromatography，LC)或液相—质谱联用( liquid chromatography-mass spectrometry，LC—MS)等传统方法[13]。近年来，还发展了一些新型的检测方法，如毛细管电泳(capillary electrophoresis，CE)法、酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)法、纳米生物传感法等[14]。为进一步提高检测的灵敏度、减少样品的前处理过程、使分析的数据更为可靠，更有效评估AA对人体的危害，文章综述比较AA检测方法的优缺点及在实际生产中的应用，旨在为开发优良检测策略提供新思路。

1 传统检测方法存在的不足

1.1 液相色谱及液质联用

使用高效液相色谱法(high performance liquid chromatography，HPLC)定量分析食品中的AA，需进行纯化处理以去除食品中的蛋白质及脂肪，防止干扰测定结果。紫外(ultraviolet，UV)与质谱(mass spectrometry，MS)是液相色谱中常见的两种检测器。因为AA缺乏足够强的生色基团(芳香环，共轭双键或三键)和自然荧光，必须使用短波长(195～205 nm)紫外线来测定，导致了LC—UV对AA的检测响应并不灵敏，且选择性欠佳。通常LC—UV仅被用来确定食品中是否含有高含量的AA，而对于低含量AA的测定灵敏度不高。因此，监测低含量的AA往往需要使用LC—MS/MS技术，质谱检测器具有高灵敏度和高选择性，避免了衍生化的步骤[14-16]，但分析成本较高。

1.2 气相色谱及气质联用

因AA并不具有低挥发性，利用气相色谱检测时，首先需要对AA进行必要的衍生化，以提高其检测灵敏度[17]。经典的方法是利用溴水衍生AA，让其转变成2，3-二溴丙烯酰胺，然后分析衍生物的谱图性质，可以得到较好的灵敏度[18]。廖燕芝等[19]对采用外标法、标准加入法、同系物甲基丙烯酰胺作内标的标准曲线法这3种定量方法测定食品中AA进行比较，发现以同系物甲基丙烯酰胺为内标，采用标准曲线法测定，定量的结果较准确。GC—MS分析中主要特征定性的离子碎片(m/z)有：152，150，108，106，并且具有一定的相对丰度比。除此之外，根据需要还可选择电子捕获检测器、高分辨率时间飞行质谱、串联质谱、氮磷检测器及火焰离子化检测器等[20-23]。

2 新型检测方法

2.1 毛细管电泳法(CE)

CE是检测食品中AA的一种相对较新且发展迅速的分析方法，能实现混合物的快速分离，且能同时分离极性和非极性化合物。其原理是在一根石英毛细管(长约50～100 cm，内径约50 μm)中充满缓冲溶液，当在毛细管两端施加高电压时，溶解在电解质中的带电化合物会以不同的速率迁移，从而实现混合物的分离。由此可见，被分离物带电是电泳分离的前提。然而，AA是一种不带电荷的化合物，要实现在电场条件下的高效分离，必须使其带上电荷。不少的课题组为此展开了研究，具有代表性的有3种改进型的电泳方法。

(1) 毛细管胶束电动色谱法(micellar electrokinetic chromatography，MEKC)：该法主要是在缓冲液中加入离子型的表面活性剂，AA被表面活性剂包裹，形成带电的胶束，通过检测AA胶束实现AA的定量检测。Zhou等[24]据此思路实现了食品中AA的检测。

(2) 毛细管区带电泳法(capillary zone electrophoresis，CZE)：该法通过柱前衍生使AA带电，以弹性石英毛细管为分离通道，以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间淌度和分配行为上的差异而实现分离。为了提高检测的灵敏度，Bermudo等[25]利用场放大进样系统，以CZE配备紫外检测器实现了饼干、面包、麦片、薯片和咖啡中AA的高灵敏检测，其检测下限达到了3 ng/g。为进一步提高检测的选择性与灵敏度，可配备MS检测器[26]，或使用离子阱分析器、飞行时间分析器、三重四极杆分析器[27]等先进的检测器，但会大大增加分析成本。

(3) 非水毛细管电泳(non-aqueous capillary electrophoresis，NACE)：该法是一种能实现AA检测的CE方法[28]。AA在水相中是极性且不带电荷的化合物，不能在电场移动，而在低pH值的非水有机相中能质子化，比如乙腈，可使其带电，进而能在电场的作用下移动。这种NACE已实现了油炸土豆片中AA的高灵敏检测，其检测下限达到了4.4 ng/mL[29]，要比CZE的检测灵敏度更高[30]。

电泳技术作为一种检测食品中AA的有效分析方法，主要是其具有进样量小，分析快速，设备相对简单，同时能实现高灵敏检测等优点。与高效液相色谱技术比较，电泳技术的优势在于不需要复杂的样品前处理过程。

2.2 酶联免疫吸附试验法(ELISA)

ELISA是一种基于抗原与抗体的高特异反应连接酶，通过检测酶催化底物产生颜色反应，从而实现快速定量的方法。AA属小分子半抗原，缺乏强的表位组，无免疫原性[31]。因此，完全抗原的获得必须首先与大分子的免疫载体蛋白连接，然后，通过刺激复杂的完全抗原发生免疫反应生成抗体。到目前为止，有3种较为普遍的方法。

(1) 最常见的方法是使用活性酯结合AA和蛋白质，如1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)-碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(N-hydroxy succinimide，NHS)。研究[32-33]表明，“AA-亲和基团”和载体蛋白之间的交联长度是获得高效价抗体的关键。王宵雪等[33]利用AA与两种AA的模拟分子(丙烯酰胺基丁酸与丙烯酰胺基苯甲酸)制备了3种AA人工抗原，并进行了动物的免疫试验，进而得到了高效价的抗体；其中，由丙烯酰胺基苯甲酸人工抗原获得的抗体表现出最高效价。与此同时，该抗体也表现出很高的特异性，经测定针对1 μg/mL衍生产物的抑制率达到了80.7%，而针对AA及对巯基苯甲酸均无交叉反应。该研究为建立快速检测食品中AA的ELISA方法奠定了较好的基础。Wu等[34]也进一步验证了上述观点。原因可能是当偶联点远离待测物的特征结构部分和官能团时，载体蛋白对小分子结构的屏蔽作用最小[35]。但是这种方法需要衍生化AA，增加了分析的时间。

(2) 直接利用戊二醛进行共轭。以两个醛基为活性基团，通过形成席夫碱来连接蛋白氨基和AA[36]。付云洁等[37]利用这种方法结合AA和牛血清白蛋白来合成人工抗原。该法简单方便，但可能会导致低效，甚至造成抗原表位的进一步损耗。

(3) 用N-丙烯酸琥珀酰亚胺酯(N-acrylic succinimide ester，NAS)作为半抗原[38-39]。NAS包含AA和NHS的结构，这有利于NAS与氨基反应且直接与AA在载体蛋白上进行共轭。Zhou等[38]用这种方法来合成具有高抗体—抗原结合常数(Kaff = 6.7×107L/mol)的完全抗原。此方法对试剂或活化没有要求，能显示出高耦合效率，且能保持共轭中AA的完整结构。

总体来讲，相比传统的检测方法，ELISA法尽管在检测的灵敏度上没有优势，但是，该法分析速度快，花费少，且不需要昂贵的仪器与复杂的样品前处理过程。开发ELISA试剂盒有不错的市场前景。Frank等[40]开发的ELISA试剂盒的检测下限为5 g/kg，线性范围为10～10 000 g/kg，具有较高的回收率，完全能满足市场需求。然而，如何获得高特异性与亲合力的抗体依然是未来需要努力的方向。

2.3 超分子识别法

“主”超分子和“客”分子之间的高度选择性和稳定性是由于分子间的相互作用和大环效果。基于超分子化学性的分子印迹技术(molecular imprinting technique，MIT)已在液相色谱、固相萃取和传感食品分析领域中得到应用[42]，并被认为是“化学抗体”。如权英等[43]以AA的结构类似物丙酰胺为模板分子，甲基丙烯酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，采用本体聚合法制备出了对AA具有较好选择性的分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymer，MIP)。MIT是制备对特定目标分子具有特异性识别能力的高分子材料的技术，所制备的MIP具有构效预定性、特异识别性和广泛实用性三大特点。因此，在食品样品的前处理和识别应用方面，MIT将有望解决许多棘手的样品前处理问题。

2.4 纳米生物传感法

纳米生物传感法是一种较有前景的食品中AA的定量检测方法。与其他方法相比，具有价格较低、抗复杂基质的干扰能力强、选择性强、灵敏度高等[44]诸多优点。基于此，生物传感器已被广泛用于病原微生物及其毒素的检测，以及监测农药、过敏原和抗生素的水平[44]。生物传感器是一组可以将具有解析活性的生物部分(生化受体)连接到各种处理器的传感器[45]。按照响应原理的不同，可以把生物传感器分为多种类型。在众多种类的生物传感器中，电化学生物传感方法与荧光传感方法是检测AA最常见的方法。

2.4.1 电化学生物传感方法 电化学生物传感方法是一种常见的用来定量分析食品中AA的新型生物分析技术。该方法主要是通过使用高选择性的生物受体来实现被分析物的定量检测。这种传感器的生物组分可以是酶、酶蛋白、抗体、天然受体、整个微生物、组织片段、单细胞、DNA和RNA。处理器将生物反应转换成生物性的或生化信号，或可以被进一步放大并变为可测量的分析电信号。监测电流与电压的变化是最常见的两种类型，比较有代表性的有循环伏安分析法(cyclic voltammetry，CV)和方波伏安分析法(square wave voltammetrya according to Osteryoung，OSWV)。

血红蛋白(hemoglobin，Hb)可以作为AA的受体，这是因为AA可以与位于Hb多肽链N-末端的缬氨酸a-NH2基团之间发生迈克尔加成反应，形成Hb-AA复合物，具有较高的亲合力。在醋酸盐缓冲液中表面活性剂二甲基双二十八烷基溴化铵(dimethyldioctadecylammonium bromide，DDAB)与Hb形成脂质体DDAB-Hb，将Hb固定于涂层了DDAB-Hb的碳糊电极上，AA的加入诱导Hb的结构发生了变化，从而改变电极的活性，进而产生响应信号，实现AA的高灵敏检测(1.2×10-10mol/L)[46]。血红素作为Hb的辅基，电极表面上的Hb-AA复合物浓度增加时，使得血红素中发生Fe(Ⅲ)离子还原成Fe(Ⅱ)离子的不可逆反应。伏安分析法测定结果提供了有关电化学反应定量和定性的信息，及关于测试样品中的AA含量的准确信息[47]。

在信号处理器表面上固定生物成分需要确保该生物材料的稳定性，这是构建生物传感器的关键问题。生物分子如Hb吸附在电极的表面上经常会导致其变性和失活。许多研究人员[47-49]进行了优化固定化的方法，旨在提高检测的稳定性。能维持电化学反应电子转移的碳纳米管与胶体金是充当生物元件的稳定剂的较好选择[48]。Krajewska等[47]使用的伏安电化学生物传感器含有固定化的Hb和修饰了单壁碳纳米管的玻碳电极(glassy carbon electrodes，GCE)，用于食品提取液中AA的检测，结果表明，电极的敏感性不受从薯片中提取的基质组分的影响；在该条件下，OSWV要比CV的灵敏度更高，其检测限低至1.0×10-9mol/L。Garabagiu等[49]先在玻璃电极表面上沉积金纳米颗粒和铟锡氧化物，然后修饰Hb，利用AA和Hb之间的相互作用，也实现AA的高灵敏检测(检测限低至10-8mol/L)。

紫外可见光谱已证实了AA与DNA能相互作用。根据这种相互作用，Li等[50]提出一种用于电化学测定AA的无标记DNA传感器。先用氧化石墨烯(graphene oxide，GO)涂覆在GCE表面上，然后将DNA吸附固定在GO/GCE上，形成DNA/GO/GCE传感器。由于GO的表面积较大，DNA能有效地固定在电极表面上。此外，GO独特的纳米结构和优异的电子传递能力显著促进了DNA电子的直接转移。在GO/GCE上DNA显示了两个可用作响应AA电化学信号的强氧化峰。结果表明，该传感器有良好的再现性和高稳定性。

Wang等[51]在MIP膜的基础上构建了新型检测AA的电化学传感器。金纳米颗粒通过Au-S键和氢键的相互作用对GCE进行修饰，然后对氨基苯硫酚和AA在金纳米颗粒的表面上进行修饰，聚合物膜由含有对氨基苯硫酚、氯金酸、四丁基高氯酸铵和一个虚拟模板分子丙酰胺的聚合物溶液电聚合而成。在移除AA后获得了一种新型的分子印迹传感器，其检测限为0.5×10-12mol/L，线性响应范围为1×10-12～1×10-7mol/L。该研究提供了一种快速，灵敏和实时地检测样品中AA的方法，且无需复杂的预处理。

电化学生物传感检测AA不需要复杂的样品前处理，主要得益于电化学信号能抵抗基质成分引起的干扰，使得该法的操作十分简便，有望替代传统的液相色谱、气相色谱法。

2.4.2 荧光传感方法 荧光传感方法用于检测生物分子、离子等得到了广泛应用。但是用于检测AA的报道并不多见。最近，Hu等[52]提出了一种基于AA聚合量子点(quantum dots，QDs)独特光物理性质的新型荧光传感检测AA方法。该研究中，在QDs表面修饰NAS后，经紫外线的诱导，NAS上的碳—碳双键发生聚合，导致QDs之间的距离减小，进而导致QDs的荧光强度发生变化。在AA的存在下，由于AA会参与聚合反应，使QDs之间的距离增大，从而增加了荧光强度。因此，根据AA的浓度与荧光强度变化的相关性可建立用于检测AA的方法。其线性范围和检测限分别为35～350 000 μg/kg和35 μg/kg。与传统方法和电化学生物传感方法相比，因其灵敏度并不高，应用将受到限制。

Liu等[53]研究了另一种检测食品中AA的荧光方法。AA通过霍夫曼反应降解生成乙烯胺，该物质能与荧光胺反应生成吡咯烷酮，从而致使其在480 nm下有强荧光发射。荧光强度随着AA的增加而增加，且具有良好的相关性系数(r2=0.99)。这种方法表现出与传统方法相类似的灵敏度与重现性。然而高温反应条件限制了本方法用于在线检测食品中的AA。

荧光传感方法具有操作方便以及不需要大型仪器等优点。然而，与传统方法和电化学生物传感方法相比，基于化学反应的荧光传感方法有灵敏度低和选择性欠佳的缺点，还需要进一步研究。未来开发荧光传感检测AA的方法，需要考虑以下两个问题：① 如何有效利用AA分子中的官能团(比如，碳碳双键)，结合纳米荧光颗粒的光学性质，设计出高灵敏的检测策略，以提高其检测的灵敏度；② 如何克服食品中共存物质对选择性的影响。

3 结论

综上所述，已有的食品AA检测方法均各具优缺点。不同的食品基质需要不同的样品前处理方法，也就说明没有一个固定可行的方法能适应所有类型的产品。通过不同酶联免疫吸附试验法获得具有高亲合力、高特异性的AA相关抗体，可以为开发高选择性的，且省略复杂样品前处理的生物传感方法奠定良好的基础。纳米材料在电学和光学方面的优良特性为开发高灵敏度、高通量、重现性良好的纳米传感方法提供了思路。未来检测AA的方法将朝着简化样品前处理，快速、低价、现场即时检测等方向发展。

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New determination methods of acrylamide in food products

WANGZi-meng1LUDai1SHIXing-bo1,2,3DENGJie-hong1

(1.CollegeofFoodScienceandTechnology,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China;2.OrientScience&TechnologyCollege,HunanAgriculturalUniversity,Changsha,Hunan410128,China;3.StateKeyLaboratoryofChemo/BiosensingandChemometrics,HunanUniversity,Changsha,Hunan410082,China)

Acrylamide (AA) is a kind of neurotoxin and potential carcinogen, formed in heating food treatment, has been aroused extensive attention in all over the word. Accurate determination of AA in complex food system is the first importance to evaluate its harmful effects on human health. In this paper, the disadvantages of traditional determination methods of AA, including liquid chromatography, gas chromotography and their coupling technique, were reviewed. Moreover, the complex of sample pretreatment process, requirement of necessary sample derivatives and professional analyzer, and expensive analytical instruments etc. were focused on. Furthermore, several new determination methods, such as capillary electrophoresis, enzyme-linked immunosorbent assay method, super-molecular recognition method, and nano-biosensor, etc. were introduced in detail. The advantages, disadvantages and the existing problems of the current determination methods in practical application were also indicated. Summarizing these methods were helpful to provide thoughts to develop more practical methods. In the future, the promising determination methods should satisfy many merits, including simple sample preparation, rapid and time-saving, low-costing, point-of-care testing and so on.

acrylamide; determination; capillary electrophoresis; enzyme-linked immunosorbent assay; super-molecular recognition method ; nano-biosensor

国家自然科学青年基金(编号：31301484)；湖南省自然科学青年基金(编号：2015JJ3082)；湖南农业大学青年项目(编号：14QN11，14QNZ14)；化学生物传感与计量学国家重点实验室(湖南大学)开放项目(编号：Z2015025)

王紫梦，女，湖南农业大学在读硕士研究生。

石星波(1984—)，男，湖南农业大学副教授，博士。

E-mail: shixingbo123@aliyun.com

2016—07—02

10.13652/j.issn.1003-5788.2016.10.046

邓洁红(1967—)，女，湖南农业大学教授，博士。

E-mail: hongjiedeng@163.com