转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶表达变化

石宇雄，郭智维，缪莉，谭志琴

(中国人民解放军第169医院，湖南衡阳 421002)



转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶表达变化

石宇雄，郭智维，缪莉，谭志琴

(中国人民解放军第169医院，湖南衡阳 421002)

目的 观察转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力及M2型丙酮酸激酶(PKM2)表达变化。方法 培养人胃腺癌MGC-803细胞，将其分为观察组1、对照组1、观察组2、对照组2，观察组1转染miR-185类似物，对照组1转染无关序列，观察组2转染PKM2小RNA干扰，对照组2转染RNA干扰无关序列，48 h后收集观察组1和对照组1细胞，用Western blotting法检测PKM2蛋白，用实时荧光定量PCR法检测PKM2 mRNA;将四组细胞继续培养24、48、72、96 h，采用MTT法测量各组在570 nm波长处的OD值。结果 细胞培养48、72、96 h时，OD值观察组1较对照组1低(P均<0.05)，观察组2较对照组2低(P均<0.05)。观察组1、对照组1人胃腺癌MGC-803细胞PKM2蛋白相对表达量分别为0.522±0.065、0.937±0.111，PKM2 mRNA相对表达量分别为0.584±0.037、1.046±0.058，两组比较，P<0.05或<0.01。结论 转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力下降、PKM2表达降低，miR-185的这一作用是通过下调PKM2实现的。

微小RNA-185类似物；基因转染；胃癌；人胃腺癌MGC-803细胞；M2型丙酮酸激酶；细胞增殖

miRNA是一类在真核生物中广泛表达且具有调控功能的非编码RNA，由18～25个核苷酸组成。miRNA通过促进其靶mRNA降解或抑制其翻译，在转录后调控基因的表达，从而参与调控生物体的一系列生理病理过程[1]。miRNA参与多种肿瘤发生发展过程，这可能与其参与调控细胞线粒体功能(如能量代谢、细胞凋亡、分裂/融合等)有关。研究[2～5]显示，miR-185在胶质瘤、卵巢癌、肺癌、肝细胞癌、结肠癌以及横纹肌肉瘤等肿瘤组织或细胞中表达下调，且能抑制多种肿瘤细胞的生长与侵袭。miR-185在胃癌组织和细胞中表达下调，且miR-185在胃癌组织中表达与患者临床分期、淋巴结转移以及预后相关，体外实验证实外源高表达miR-185可抑制胃癌细胞的增殖、侵袭并诱导胃癌细胞凋亡，体内实验亦证实miR-185能抑制癌细胞肺转移[6]。然而miR-185在胃癌中的具体抑癌机制尚未阐明。M2型丙酮酸激酶(PKM2)在多种肿瘤(肺癌、前列腺癌、胶质瘤)中能促进有氧糖酵解与肿瘤的发生[7～9]。前期研究显示miR-185的非编码区有与PKM2结合的共同位点。转染miR-185类似物可以使胃癌细胞出现外源性miR-185高表达。本研究观察了转染miR-185类似物的人胃腺癌MGC-803细胞增殖能力、PKM2表达变化，现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 人胃腺癌MGC-803细胞购自上海细胞生物研究所，细胞均用含10%胎牛血清、1%青霉素链霉素的RPMI1640培养，置于37 ℃、5% CO2的恒温箱中培养。Lipofectamine2000转染试剂购自美国Invitrogen公司，miR-185类似物、无关序列、RNA干扰无关序列购自美国Ambion公司，PKM2小RNA干扰(PKM2-siRNA)质粒购自GeneCopoeia公司，PKM2抗体和β-actin抗体购自美国Santa Cruz公司，PRIM1640培养基和小牛血清购自Gibco公司，MTT粉购自美国Sigma公司。

1.2 MGC-803细胞分组及miR-185类似物转染 培养人胃腺癌MGC-803细胞，消化细胞并接种于6孔板中，按2 mL/孔铺好，培养至细胞汇合度达30%～50%用于转染。用灭菌的无酶水稀释各种转染质粒干粉，按说明配制成20 μmol/L的溶液备用。用不含血清的Opti-MEM培养液分别稀释100 pmol转染质粒与Lipofectamin2000(5 μL)，混匀，室温孵育5 min。将MGC-803细胞分为观察组1、对照组1、观察组2、对照组2，观察组1转染miR-185类似物，对照组1转染无关序列，观察组2转染PKM2-siRNA，对照组2转染RNA干扰无关序列，培养48 h，收获细胞。

1.3 各组MGC-803细胞增殖能力观察 采用MTT法。使用胰酶消化上述四组细胞，每组分别取1 000个MGC-803细胞接种于96孔板中，每组设5个复孔，继续培养24、48、72、96 h后，每孔加灭菌MTT液(5 mg/mL)20 μL，孵育4 h后取出，每孔中加入DMSO 150 μL，低速振荡10 min，选择波长为570 nm，在酶标仪上测定各孔OD值。实验重复3次。OD值代表细胞增殖能力。

1.4 观察组1、对照组1 MGC-803细胞PKM2检测 ①PKM2蛋白：采用Western blotting法。提取观察组1、对照组1细胞总蛋白。BCA蛋白定量试剂盒测定细胞蛋白浓度，100 ℃水浴10 min，取等量的总蛋白行SDS-PAGE凝胶电泳，并转至PVDF膜上。TBST洗膜，用含有5%脱脂奶粉的TBST封闭2 h后分别加入鼠抗人PKM2单克隆一抗4 ℃封闭过夜。去除一抗，TBST洗膜3次，加入二抗，37 ℃孵育45 min，TBST洗膜3次，暗室中用蛋白荧光检测试剂盒显示结果于X线片。以β-actin为对照。以目的蛋白条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值作为PKM2蛋白的相对表达量。②PKM2 mRNA：采用实时荧光定量PCR法。用RNA抽提试剂盒抽提观察组1、对照组1细胞中总RNA。逆转录合成cDNA于-80 ℃冰箱保存。PCR扩增反应体系为20 μL，其中包括PCR 引物(5 mmol/L)0.4 μL、逆转录产物 2.0 μL、Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL、2×SYBR Mix 10 μL、灭菌蒸馏水7.4 μL，混匀。反应条件：50 ℃ 2 min，95 ℃ 10 min后95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。溶解曲线条件：95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。以U6为内参，以2-ΔΔCt表示PKM2的相对表达量。

2 结果

2.1 各组细胞OD值比较 结果见表1。

表1 培养不同时间点各组细胞OD值比较±s)

注：观察组1与对照组1相比，观察组2与对照组2相比，*P<0.05，#P<0.01。

2.2 观察组1、对照组1细胞PKM2蛋白、mRNA相对表达量比较 观察组1、对照组1人胃腺癌MGC-803细胞PKM2蛋白相对表达量分别为0.522±0.065、0.937±0.111，PKM2 mRNA相对表达量分别为0.584±0.037、1.046±0.058，两组比较，P<0.05或<0.01。

3 讨论

胃癌的发生发展涉及多因素的参与，包括相关癌基因的激活与抑癌基因的失活。研究发现，miRNA异常表达在多种肿瘤细胞的增殖、侵袭、凋亡、周期阻滞中起着至关重要的作用。miRNA不仅可以参与正常的生命进程，其表达失调与多种疾病病理过程相关。miRNA几乎参与了所有恶性肿瘤的发生发展，主导或是协同参与调控肿瘤细胞异常增殖、细胞凋亡、血管生成、局部侵袭和远处转移等一系列重要的生物学过程。细胞异常增殖和侵袭转移对于原发肿瘤的形成、维持和进展尤为重要。目前，已经有大量的研究揭示了参与调控肿瘤细胞增殖和转移的重要miRNA。例如miR-21通过靶向下调PTEN、RECK或TIMP3等肿瘤抑制蛋白，促进乳腺癌、肺癌和食管癌等多种肿瘤细胞在体内体外的增殖、侵袭迁移、肿瘤生长和远处转移，被认为是重要的癌性miRNA[10]。Let-7则靶向多个促癌基因，如Ras、HMGA2，抑制多种肿瘤的细胞增殖、侵袭、迁移[11]。

研究显示，miR-185在包括胃癌等多种癌组织或细胞中表达下调，其通过靶向相关基因发挥癌基因或抑癌基因样作用。各种研究显示，DNMT1、CDC42、RhoA、SIX1、CDK6、雄激素受体、c-Met等均是miR-185下游调控的靶基因。研究[3]表明，miR-185在胶质瘤中表达下调，通过直接靶向DNMT1、RhoA、CDC42抑制胶质瘤细胞的增殖与侵袭。Ximena等[12]研究显示，miR-185在肝癌中表达下调，通过靶向DNMT1/PTEN/Akt通路抑制肝癌细胞的生长。miR-185在结肠癌中通过靶向抑制RhoA与CDC42表达抑制结肠癌细胞的增殖[13]。miR-185在前列腺癌通过靶向雄激素受体抑制肿瘤细胞的增殖、迁移与侵袭[14]。miR-185在乳腺癌细胞中表达下调，通过靶向抑制c-Met表达，抑制乳腺癌细胞的增殖[15]。上述研究表明，miR-185在不同类型肿瘤中的功能差异可能与其不同的功能靶基因有关。

丙酮酸激酶(PK)是糖酵解过程中的关键限速酶，其功能是催化其底物磷酸烯醇式丙酮酸产生丙酮酸。在人体主要存在四种PK，即PKL、PKR、PKM1和PKM2。PKM2首先在胚胎组织中被发现，而近年的研究发现PKM2在快速增殖的细胞(特别是肿瘤组织)中高表达，对Warburg效应及肿瘤发生发展发挥重要的调控作用[16,17]。PKM2可进入细胞核，协同HIF-1α反式激活下游基因的表达，上调LDH、GLUT-1、HK1、PDK1、VEGFA等，对肿瘤能量代谢起重要的调控作用[18]。同时PKM2入核后还可协同激活β-Catenin、STAT3、Oct-4下游基因的表达，促进肿瘤细胞的生长增殖[19,20]。用siRNA特异性敲除PKM2，可显著抑制肿瘤能量代谢，并抑制肿瘤的生长、增殖及迁移[21]。在肺腺癌A549细胞中敲除PKM2能诱导肿瘤细胞凋亡与自噬[22]。本研究结果显示，转染PKM2-siRNA的胃癌MGC-803细胞增殖能力低于转染RNA干扰无关序列者，进一步说明PKM2可以调控胃癌细胞的增殖。

前期研究[6]发现，miR-185在胃癌组织中表达下调；转染miR-185类似物可以使胃癌组织miR-185表达升高，即外源性miR-185高表达能抑制胃癌细胞的生长与侵袭并诱导细胞凋亡。前期通过在线预测软件发现miR-185的3′-UTR与PKM2存在共同结合位点。外源高表达miR-185能抑制PKM2的蛋白与mRNA表达，提示PKM2是miR-185调控的靶基因。本研究结果显示，通过转染miR-185类似物使胃癌MGC-803细胞过表达miR-185后，胃癌MGC-803细胞增殖被抑制。结合在线预测软件发现，笔者推测miR-185的这一作用是通过下调PKM2实现的。。

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湖南省医药卫生科研计划课题(B2014-067)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.35.012

R735.2

A

1002-266X(2016)35-0039-03

2016-02-09)