新型鸭呼肠孤病毒σB和σC蛋白间接ELISA方法的建立

王锦祥，程晓霞，陈少莺*，陈仕龙，林锋强，王 劭，朱小丽，肖世峰

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013，2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013)



新型鸭呼肠孤病毒σB和σC蛋白间接ELISA方法的建立

王锦祥1,2，程晓霞1,2，陈少莺1,2*，陈仕龙1,2，林锋强1,2，王 劭1,2，朱小丽1,2，肖世峰1,2

(1.福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建 福州 350013，2.福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建 福州 350013)

以纯化的新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)NP03株重组σB和σC蛋白作为包被抗原，对反应条件进行优化，建立检测NDRV抗体的间接ELISA方法。优化后的最佳条件为：σB蛋白包被浓度为12.5 μg·mL-1；σC蛋白包被浓度为6.25 μg·mL-1；封闭液为15% FBS；血清稀释度为1∶80；酶标二抗稀释度为1∶400；底物37℃显色5 min。该方法对MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清均无交叉反应，具有良好的特异性。该方法与NDRV全病毒间接ELISA相比较，符合率高达92.5%。本研究进一步丰富了NDRV抗体的检测方法。

新型鸭呼肠孤病毒；原核表达；σB蛋白；σC蛋白；间接ELISA

鸭出血性坏死性肝炎是由新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus，NDRV)引起的水禽传染病。NDRV主要感染雏鸭，多种品种的鸭易感，病程5～7 d，发病率高达20%，死亡率高达15%，给养鸭业造成较大的经济损失[1-2]。NDRV归属于呼肠孤病毒科正呼肠孤病毒属，病毒基因组包含大(L1～L3)、中(M1～M3)和小(S1～S4)3组10个双链RNA片段[2-3]。其中，S3和S1基因片段编码的σB和σC是病毒的重要功能蛋白。σB能引起细胞融合并诱导产生群特异性抗体。σC介导受体结合并诱导产生型特异性抗体[3-6]。

自2009年首次鉴定该病毒后，国内学者对NDRV的诊断方法进行了初步研究。已报道的实验室检测方法有病毒分离[1]、病毒核酸检测[7-8]和σC-ELISA[9-10]。本研究在前期建立σC-ELISA的基础上[9]，以原核表达的σB和σC为检测抗原，建立了敏感性更高的σB-σC-ELISA，进一步丰富了NDRV抗体检测方法。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌株和质粒 感受态细胞BL21(DE3)购自宝生物工程(大连)有限公司，重组质粒pET-NP03-σB和pET-NP03-σC由福建省农业科学院畜牧兽医研究所构建并保存。

1.1.2 血清 NDRV阳性血清、番鸭呼肠孤病毒(MDRV)阳性血清、鸭肝炎病毒(DHV)阳性血清、番鸭细小病毒(MPV)阳性血清、番鸭源鹅细小病毒(MD-GPV)阳性血清由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存；164份NDRV阴性血清由福建省农业科学院畜牧兽医研究所保存；238份临床血清样品来自浙江、福建和广东等地区的不同鸭场，其中80份用于比较试验，158份用于临床样品的检测。

1.1.3 主要试剂 羊抗鸭HRP-IgG购自KPL公司；蛋白纯化试剂盒购自GE Healthcare公司；OPD购于Sigma公司。

1.2 试验方法

1.2.1 重组蛋白的表达、纯化和鉴定 重组表达质粒pET-NP03-σB和pET-NP03-σC分别转化BL21(DE3)感受态细胞，挑取单菌落，37℃振荡培养至OD600 nm值0.4～0.6，加入IPTG至终浓度为1 mmol·L-1，诱导表达4 h，并进行SDS-PAGE分析。按照蛋白纯化试剂盒说明书纯化重组σB和σC蛋白，通过western blot进行鉴定。

1.2.2 最佳蛋白包被浓度和血清稀释度的确定 用包被液(pH9.6碳酸盐缓冲液)将纯化的σB和σC蛋白分别按照3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 μg·mL-1稀释，包被96孔ELISA板，每孔100 μL，4℃包被过夜。NDRV阳性血清和阴性血清分别以1∶20、1∶40、1∶80、1∶160和1∶320稀释加入蛋白包被孔，经羊抗鸭HRP-IgG反应后测定OD490nm值。根据阳性血清OD490nm值大于1.0且P/N值最大确定最佳蛋白包被浓度和血清稀释度。

1.2.3 间接ELISA方法的建立 用包被液将σB和σC蛋白稀释到最佳包被浓度，共同包被96孔ELISA板，每孔100 μL，4℃包被过夜。次日经PBST洗涤后用封闭液(15% FBS)封闭。待检血清用封闭液稀释至最佳稀释度，每孔100 μL，同时加入阳性血清和阴性血清。加入用封闭液稀释的羊抗鸭HRP-IgG(1∶400)，每孔100 μL。加入OPD显色液，每孔100 μL。每孔加入50 μL 2mol·L-1H2SO4终止反应，测定OD490nm值。

S/P值=(样品OD490nm值-阴性OD490nm值)/(阳性OD490nm值-阴性OD490nm值)

1.2.5 特异性试验 应用建立的σB-σC-ELISA检测MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清，试验重复3次，验证该方法的特异性。

1.2.6 敏感性试验 将3份中和效价为1∶2的NDRV阳性血清在1∶100稀释的基础上进行连续2倍倍比稀释，应用建立的σB-σC-ELISA进行检测，验证该方法的敏感性。

1.2.7 重复性试验 选取NDRV中和抗体效价不同的8份血清，应用同一时间和不同时间包被的ELISA反应板按照建立的σB-σC-ELISA方法进行检测，每份血清重复检测8次，评价该ELISA方法的重复性。

1.2.8 比较试验 应用建立的σB-σC-ELISA和NDRV全病毒间接ELISA(NDRV-ELISA)同时检测80份临床鸭血清样品，根据试验结果计算2种方法的符合率。NDRV-ELISA由本课题组建立，步骤如下：将经密度梯度离心纯化的NDRV NP03病毒用ELISA包被液稀释至蛋白浓度为1.5 mg·mL-1，包被96孔ELISA板，每孔100 μL，37℃包被5 h；经PBST洗涤3次后用封闭液(20% BSA)封闭；待检血清用封闭液稀释至1∶40，每孔100 μL；加入用封闭液稀释的羊抗鸭HRP-IgG(1∶500)，每孔100 μL；加入OPD显色液，每孔100 μL，25℃显色8 min；每孔加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4终止反应，测定OD490nm值。

1.2.9 临床血清样品的检测 应用建立的σB-σC-ELISA方法对浙江、福建和广东等地不同鸭场采集的158份样品进行检测，计算阳性率。

2 结果与分析

2.1 σB和σC蛋白的表达、纯化和鉴定

经IPTG诱导后，重组菌pET-NP03-σB/BL21和pET-NP03-σC/BL2有明显的表达条带，分子量分别约为45 ku和40 ku，与预期的σB和σC蛋白相对分子量相符，重组σB和σC蛋白均以包涵体形式存在。对纯化蛋白进行western blot分析，结果表明σB和σC蛋白具有良好的反应原性(图 1)。

2.2 间接ELISA反应条件的确定

通过方阵滴定法确定最佳σB和σC蛋白包被质量浓度分别为12.5 μg·mL-1和6.25 μg·mL-1，最佳血清稀释度为1∶80(表1)。对反应条件进行优化后确定的最佳条件为：血清1∶80稀释，作用60 min；酶标二抗1∶400稀释，作用45 min；封闭液为15% FBS，封闭3 h；底物显色时间为5 min(表2)。

表1 最佳抗原包被浓度及血清最佳稀释度的方阵滴定结果

表2 间接ELISA检测方法的反应条件的优化

2.3 间接ELISA判定标准的确定

2.4 特异性试验

应用建立的σB-σC-ELISA检测MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清，被检血清的S/P值均小于0.151，为阴性。表明该方法与常见水禽病毒病的阳性血清无交叉反应，具有良好的特异性(表3)。

表3 间接ELISA特异性试验

2.5 敏感性试验

应用建立的σB-σC-ELISA检测3份中和效价为1∶2的NDRV阳性血清，当血清稀释度为1∶12 800时，结果仍为阳性，表明该方法具有较好的敏感性。

2.6 重复性试验

选取中和抗体效价不同的8份NDRV阳性血清，应用同一时间和不同时间包被的ELISA板进行检测。批内重复性试验的变异系数为2.93%～6.20%，批间重复性试验的变异系数为3.21%～6.78%。表明该ELISA方法具有较好的稳定性(表4)。

表4 间接ELISA重复性试验

2.7 比较试验

应用建立的σB-σC-ELISA和NDRV-ELISA同时检测来自浙江、福建和广东等地不同鸭场的80份临床血清样品，根据结果统计出两者的符合率为92.5%(表5)。

表5 σB-σC-ELISA和NDRV-ELISA方法的比较试验

2.8 临床样品的检测

应用建立的σB-σC-ELISA方法对浙江、福建和广东等地不同鸭场的158份临床血清样品进行检测，检出阳性血清61份，阳性率为38.6%(61/158)。

3 讨论与结论

自2009年首次鉴定鸭出血性坏死性肝炎的病原为NDRV以来，该病的疫区有逐年扩大的趋势，给我国水禽业的发展造成了较大的危害[12-13]。因此，建立敏感、高效的检测方法对该病的预防和控制具有十分重要的意义。本研究在前期建立σC-ELISA的基础上[9]，以原核表达的σB和σC蛋白为检测抗原，建立了敏感性更高的σB-σC-ELISA方法，为NDRV的快速诊断和疫情控制提供更准确的依据。

σB和σC蛋白是NDRV外衣壳表面的重要结构蛋白，2种蛋白均能诱导机体产生特异性抗体。在本试验中，原核表达的σB和σC蛋白均具有良好的反应性，且与MDRV、DHV、MPV和MD-GPV阳性血清均无交叉反应，具有良好的特异性。因此，本试验制备的重组蛋白能作为包被蛋白建立间接ELISA方法。本试验建立的σB-σC-ELSIA与NDRV-ELISA的符合率为92.5%，比σC-ELISA的88.75%高出约4.0%[9]，说明σB-σC-ELSIA是一种比σC-ELISA敏感性更高的NDRV抗体检测方法。采用该方法用于大批量临床血清样品的检测能够提供更准确的数据，同时也为敏感性和准确性更高的NDRV抗体检测试剂盒的研制奠定基础。

[1]陈少莺，陈仕龙，林锋强，等. 一种新的鸭病(暂名鸭出血性坏死性肝炎)病原学研究初报[J]. 中国农学通报，2009，25(16)：28-31.

[2]陈少莺，陈仕龙，林锋强，等. 新型鸭呼肠孤病毒的分离与鉴定[J]. 病毒学报，2012，28(3)：224-230.

[3]王劭，陈少莺，陈仕龙，等. 新型鸭呼肠孤病毒NP03株S3基因序列分析[J]. 农业生物技术学报，2010，18(3)：567-572.

[4]ZHANG Y, GUO D C, LIU M, et al. Characterization of the σB-encoding genes of muscovy duck reovirus: σC-σB-ELISA for antibodies against duck reovirus in ducks[J]. Vet Microbiol, 2007, 121(3-4):231-241.

[5]王锦祥，程晓霞，陈少莺，等. 新型鸭呼肠孤病毒σC基因原核表达及其抗原性的初步研究[J]. 福建农业学报，2014，29(4)：310-313.

[6]ZHU Y Q, LI Y F, BI Z L, et al. Protective immune responses in ducklings induced by a suicidal DNA vaccine of the sigma C gene of nocel duck reovirus[J]. Vet Immunol Immunopathol, 2015, 165(1-2):88-92.

[7]王劭，陈少莺，陈仕龙，等. 新型鸭呼肠孤病毒RT-PCR方法的建立与应用[J]. 农业生物技术学报，2011，19(2)：388-392.

[8]袁远华，吴志新，王俊峰，等. 新型鸭呼肠孤病毒SYBR Green I实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2013，35(9)：738-741.

[9]王锦祥，程晓霞，陈少莺，等. 新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白间接ELISA检测方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2015，37(9)：687-690.

[10]YUN T, CHEN H P, YU B, et al. Development and application of an indirect ELISA for the detection of antibodies to novel duck reovirus[J]. J Virol Methods, 2015, 220:55-59.

[11]董井泉，张蕾，马波，等. 1型鸭肝炎病毒VP1蛋白优势抗原区的鉴定及抗体检测ELISA方法的建立[J]. 中国预防兽医学报，2014，36(7)：542-546.

[12]ZHU Y Q, LI C F, BI Z L, et al. Molecular characterization of a novel reovirus isolated from Pekin ducklings in China[J]. Arch Virol, 2015, 160:365-369.

[13]袁远华，王俊峰，吴志新，等. 1株番鸭源新型鸭呼肠孤病毒(QY株)生物学鉴定[J]. 中国兽医学报，2013，33(8)：1174-1178.

(责任编辑：林海清)

Development of Indirect ELISA for Detecting Novel Duck Reovirus Using σB and σC Proteins as Coating Antigens

WANG Jin-xiang1,2, CHENG Xiao-xia1,2, CHEN Shao-ying1,2, CHEN Shi-long1,2, LIN Feng-qiang1,2,WANG Shao1,2, ZHU Xiao-li1,2, XIAO Shi-feng1,2

(1.InstituteofAnimalHusbandryandveterinaryMedicine,FujianAcademyofAgricultureSciences,Fuzhou,Fujian350013,China; 2.FujianAnimalDiseasesControlTechnologyDevelopmentCenter,Fuzhou,Fujian350013,China)

An indirect ELISA was developed using the purified recombinant novel duck reovirus(NDRV)σB and σC proteins as coating antigens. The optimized conditions for the methodology were determined to include: concentrations of σB at 12.5 μg·mL-1and σC at 6.25 μg·mL-1,a blocking buffer of 15% FBS, serum samples being diluted 80 times, goat anti-duck HRP-IgG being diluted 400 times,and substrate incubation at 37℃ for 5 min. The assay was found to be specific without any cross reaction with antibodies of MDRV, DHV, MPV, or MD-GPV. The coincidence rate between the indirect ELISA coated with the recombinant σB and σC proteins and that coated with NDRVwas 92.5%. It appeared that the newly developed ELISA exhibited satisfactory sensitivity and specificity on measurements,and could be an alternative means for detecting anti-NDRV antibodies.

novel duck reovirus; prokaryotic expression;σB protein;σC protein; indirect ELISA

2016-03-04初稿；2016-05-12修改稿

王锦祥(1983-)，男，博士，助理研究员，主要从事分子病毒学研究

*通讯作者：陈少莺(1962-)，女，硕士，研究员，主要从事动物传染病病原与防治研究(E-mail：chensy58@163.com)

福建省自然科学基金项目(2014J05036)；福建省科技计划项目——省属公益类科研院所基本科研专项(2016R1022-11)

S 852

A

1008-0384(2016)09-903-05

王锦祥，程晓霞，陈少莺，等.新型鸭呼肠孤病毒σB和σC蛋白间接ELISA方法的建立[J].福建农业学报，2016，31(9)：903-907.

WANG J-X，CHENG X-X，CHEN S-Y，et al.Development of Indirect ELISA for Detecting Novel Duck Reovirus Using σB and σC Proteins as Coating Antigens[J].FujianJournalofAgriculturalSciences，2016，31(9)：903-907.