桔梗试管苗再生体系优化研究

2016-12-04天津农学院农学与资源环境学院天津300384

种子 2016年11期

，， (天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384)

·种子生产·

桔梗试管苗再生体系优化研究

陈小强，张亚鹤，孙宁
(天津农学院农学与资源环境学院，天津 300384)

桔梗有极高的药用作用和观赏价值。本试验以桔梗试管苗为外植体，通过筛选最适桔梗试管苗叶片愈伤组织诱导、分化、生根激素种类和浓度，对其再生体系进行优化。结果表明，最适的愈伤组织诱导培养基为：MS+4 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂；最适分化培养基为：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂；最适生根培养基为：1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂。

桔梗；试管苗；愈伤组织；激素；再生体系

桔梗是桔梗科桔梗属多年生草本植物[1]。桔梗具有极高的药用价值、观赏价值及使用价值[2]。随着桔梗的各种功用和价值被人们开发利用，市场需求量日益增大，使得野生桔梗遭受过度的采挖甚至破坏，极大地影响了生态系统的稳定性、多样性和物种的群体遗传结构[3]。

在生产上，因桔梗是异花授粉植物，主要进行有性繁殖，自然界和生产中推广的桔梗都是混杂的群体，到目前为止还没有纯系[4]。而且，有性繁殖不利于保持个体的优良性状。通过植物组织培养的方法，不仅可以保持植株的优良性状，而且可以加快其繁育速度，实现工厂化育苗，对保持种质资源，新品种的培育具有重要意义。

本试验通过筛选最适桔梗试管苗叶片愈伤组织诱导、分化、生根的激素的种类和浓度，对其再生体系进行优化，希望得到桔梗再生体系所需要的各阶段最适培养基配方，为桔梗种质资源保存、培育新品种以及工厂化育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

桔梗(Platycodongrandiflorus)，来源于天津农学院植物细胞工程研究中心。以无病害、健康生长、品质优良的桔梗试管苗为研究材料。

1.2 试验方法

1.2.1 桔梗试管苗叶片诱导愈伤组织

取健壮生长、品质优良的桔梗试管苗，在超净工作台上操作。将健康的试管苗叶片剪成0.5 cm×0.5 cm的正方形，接种到不同的培养基中(A 1～A 4)。每个处理30重复瓶，每瓶接2个叶片。接种后培养30 d，观察愈伤组织形态并统计出愈率。将MS培养基作为基础培养基，碳源选择30 g/L蔗糖,琼脂6.5 g/L。添加植物激素如表1。

表1 愈伤组织诱导培养基植物激素配比

序号植物激素(mg/L)2，4⁃D6⁃BANAAA13A24A30．10．1A40．50．5

1.2.2 桔梗试管苗分化培养

取健康生长的桔梗试管苗愈伤组织，在超净工作台上切剥成0.5 cm3的小块。接种到培养基(B 1～B 9)中。接种后培养30 d，统计桔梗不定芽分化率并观察不定芽状态。每个处理重复接15瓶，每瓶接2个愈伤组织。以MS培养基作为基础培养基，碳源选择30 g/L的蔗糖,琼脂6.5 g/L。将6-BA和NAA都分为3个浓度梯度(6-BA：0.5、1、2 mg/L；NAA：0.05、0.1、0.2 mg/L)，利用正交设计法选出最适宜桔梗不定芽分化的培养基。添加的植物激素种类、浓度如表2。

表2 分化培养基植物激素配比

因素水平(mg/L)6⁃BA0．51．02．0NAA0．050．10．2

1.2.3 桔梗试管苗生根培养

取健壮生长、品质优良的桔梗试管苗，在超净工作台上操作，将桔梗试管苗转入到生根培养基(C 1～C 3)中。接种后培养40 d，统计出根率、平均根长以及根的状态。每个处理接30瓶，每瓶接2个。设定1/2 MS培养基作为基础培养基，蔗糖30 g/L，琼脂6.5 g/L。NAA分成3个浓度梯度(0.1、0.25、0.5 mg/L) ，筛选出最适合桔梗生根培养基。C 1：1/2 MS+0.1 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂；C 2：1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂；C 3：1/2 MS+0.5 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂。

1.3 培养条件

培养室的温度保持在(25±2)℃，相对湿度70%～80%，光照时间14～16 h/d，光照强度1 000～5 000 lx。

1.4 试验数据统计

出愈率(%)=生长出的愈伤组织个数/接种叶片个数×100%；

不定芽诱导率(%)=分化出芽/接种的愈伤组织个数×100%；

生根率(%)=生根的个数/接种个数×100%；

平均根长(cm)=根总长度/根数。

2 结果与分析

2.1 不同激素浓度配比对桔梗试管苗叶片出愈率的影响

按照试验方法操作，将桔梗试管苗剪切后的叶片作为外植体，接种到添加不同浓度植物激素的诱导培养基中(A 1～A 4)，经过30 d的培养后，统计桔梗叶片诱导愈伤组织情况，包括出愈率和愈伤组织状态，具体见表3，图1。

表3 桔梗叶片诱导愈伤组织情况

处理接种数(个)愈伤数(个)出愈率(%)愈伤组织状态A1603050．00黄绿色、少量愈伤A2604168．33绿色、浓密愈伤A3601728．33浅黄色、少量愈伤A4601830．00浅黄色、少量愈伤

从图1可以得出，处理组A 1、A 2都高于A 3、A 4，这说明，在本试验中，2,4-D对桔梗试管苗叶片的愈伤组织诱导，明显高于6-BA和NAA的配比。当2,4-D浓度为3 mg/L时，出愈率达50%；当浓度上升为4 mg/L，出愈率为68.33%，此时愈伤组织呈绿色，比A 1组颜色稍深，数量较多。当使用6-BA和NAA配比的植物激素时，出愈率为30%左右，愈伤组织呈黄白色，虽然A 4组比A 3组好些，但远不如添加2,4-D的A 1，A 2处理组。综合比较，A 2处理的出愈率最高(68.33%)，而且愈伤组织形态最好，呈现为绿色且较为浓密，见图2。此时最适的培养基配方为MS+4 mg/L 2,4-D+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂。

图1 不同激素处理对桔梗试管苗出愈率影响

图2 桔梗愈伤组织(30 d)

2.2 不同激素浓度配比对桔梗试管苗分化的影响

将桔梗愈伤组织接种到B 1～B 9分化培养基中，经过30 d的培养后，统计分化率、不定芽状态如表4。

从图3可以看出，当6-BA浓度一定时，NAA浓度越高，愈伤组织分化率越高。当NAA浓度一定时，桔梗试管苗不定芽分化率随6-BA增加而减少。不定芽状态也随6-BA浓度增加而变差。

由表4可知，分化率最高的是B 3培养基，分化率为80%。B 7培养基分化率最低，为20%。对正交试验结果进行分析得出：各因素的极差由大到小依次为R NAA(26.670)gt;R 6-BA(25.553)，由此得出，各因素对分化率影响大小为NAAgt;6-BA。对于因素6-BA，K1(64.443)gt;K2(56.667)gt;K3(38.890)，说明不同浓度的6-BA对桔梗分化率能力由强到弱依次为0.5gt;1.0gt;2.0。对于因素NAA，K3(67.780)gt;K2(51.110)gt;K1(41.110),说明不同浓度的NAA对桔梗分化率能力由强到弱依次为0.2gt;0.1gt;0.05。比较各个因素K值，最大的K值是因素NAA的K3(67.780)，因素6-BA的K1(64.443)。因此理论上9种培养基中最适合的处理组为B 3。

图4 C 1～C 3组桔梗试管苗生根情况

当6-BA浓度为0.5 mg/L，NAA浓度为0.2 mg/L，不定芽分化率最高，不定芽状态最好。确定最适的分化培养基配方为：MS+0.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂。

表4 桔梗不定芽分化情况

处理植物激素6⁃BANAA不定芽(个)分化率(%)不定芽状态B10．50．051653．33+B20．50．11860．00++B30．50．22480．00+++B41．00．051550．00++B51．00．11653．33+B61．00．22066．67++B72．00．05620．00-B82．00．11240．00+B92．00．21756．67+K164．44341．110K256．66751．110K338．89067．780R25．55326．670

注：“+++”表示分化状态情况良好，“++”表示分化状态情况较好，“+”表示分化状态情况一般，“-”表示分化状态情况差。

2.3 不同激素浓度配比对桔梗试管苗生根的影响

按照试验方法操作，桔梗试管苗接种到C 1～C 9培养基，在经过40 d的培养后，统计出根率、平均根长、根部状态(表5)。

表5 桔梗生根情况

处理接种数(个)污染数(个)生根数(个)出根率(%)平均根长(cm)根状态C16034981．671．75极细，数目少C26015490．002．81粗壮，密集丛生数目多C36025795．002．12较细，数量较多

由表5和图4可知，当NAA浓度为0.1 mg/L时，根极细，且数目少(图4 C 1)；当浓度为0.25 mg/L，根非常粗壮，密集，数量很多(图4 C 2)。当浓度为0.5 mg/L，根较粗，数量较多(图4 C 3)；可以得出，生根率最高的虽然是NAA为0.5 mg/L的C 3组处理(达94.44%)，但观察试管苗生根情况却发现，C 2组长势明显好于C 3处理组。C 2组根密集丛生，根的数目非常多，且非常粗壮；C 3组根的数目虽然长，但普遍较细。所以，本试验中，最适宜桔梗试管苗茎段生根的培养基为1/2 MS+0.25 mg/L NAA+30 g/L蔗糖+6.5 g/L琼脂。

图3 不同激素处理对桔梗不定芽分化的影响

3 讨论

3.1 不同浓度植物激素配比对桔梗试管苗愈伤组织形成的影响

愈伤组织是指植物在局部受到创伤或刺激后，在伤口附近形成新生的组织。在离体培养中，细胞经过脱分化等过程，继而转变成一种可以迅速增殖的细胞团，即为愈伤组织。由本试验结果可以看出，不同激素配比对桔梗试管苗叶片快繁中愈伤组织的形成有显著影响。从目前的研究成果来看，采用2,4-D或6-BA、NAA配比来诱导愈伤的方案比较多。2种方案在当前研究中都有试验的数据支撑。张凤生等的试验结果表明，在植物激素种类为6-BA和NAA时，愈伤组织诱导效果好，呈现良好的绿色颗粒状，且愈伤组织数目较多[5]。王桂梅等的试验结果也指出，6-BA和NAA有利于诱导愈伤组织[6]。曾思思等利用桔梗为外植体，研究愈伤组织的诱导，明确指出，2,4-D是诱导愈伤组织的关键激素[7]。舒娈认为，2,4-D诱导愈伤组织的效果非常强，诱导率可达100%[8]。本试验也验证了这点，认为4 mg/L的2，4-D对桔梗愈伤组织诱导是最有利的。从出愈时间来看，本试验中，平均出愈时间为16～25 d，而吴京姬等的试验指出，在添加6-BA和NAA的培养基接种7 d后，叶片周围的伤口的细胞团即可长出愈伤组织[9]。出愈时间可能与桔梗品种有关。

3.2 不同浓度激素配比对桔梗试管苗愈伤组织分化的影响

不同激素配比对桔梗试管苗愈伤组织分化的影响也不同。张燕等指出，桔梗愈伤组织分化的培养基添加的最适激素为6-BA和NAA[10]，这与陈庆亮等[11]的试验研究结果一致。本试验利用正交设计法探究不同激素配比对愈伤组织分化影响，选出最适宜桔梗不定芽分化的培养基。试验结果表明，6-BA浓度一定时，NAA浓度越高，愈伤组织分化率越高。B 3组处理中，当6-BA浓度为0.5 mg/L，NAA浓度为0.2 mg/L时，愈伤组织分化率最高，可达80%。

3.3 不同浓度激素配比对桔梗试管苗生根的影响

在桔梗试管苗生根阶段，NAA是大家普遍认同的能促进根分化的植物激素。但使用质量浓度有分歧，基本在0.1～0.5 mg/L。例如唐伟斌等在试验中明确指出，添加NAA能有效促使根系生长，最适的生根配方是添加浓度为0.5 mg/L NAA 的培养基[12]。同样认为，NAA有利于生根的有曾宣姣等[13]的试验，但最终确定的NAA浓度梯度与前者不同，后者认为，NAA选用0.1 mg/L效果最佳。基于上述都是将桔梗试管苗作为外植体，添加不同浓度的NAA，但试验结果不同，显示的浓度范围较大，综合多个试验项目，本试验控制单一变量，将NAA浓度设置为0.1 mg/L、0.25 mg/L、0.5 mg/L 3个梯度。经过40 d培养可得出，生根率最高的是第C 3组处理(NAA为0.5 mg/L)，生根率达94.44%，但试管苗形态根据图4可发现C 2组长势明显好于C 3处理组。C 2组根密集丛生，根的数目多且非常粗壮；C 3组根的数目虽然也多，但普遍较细。