老芒麦和紫芒披碱草及其杂种F1代与BC1代的ISSR分析

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(1.内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特 010019； 2.内蒙古自治区园艺研究院， 呼和浩特 010010)

老芒麦和紫芒披碱草及其杂种F1代与BC1代的ISSR分析

李小雷1，鲍红春2，于卓1

(1.内蒙古农业大学农学院， 呼和浩特 010019； 2.内蒙古自治区园艺研究院， 呼和浩特 010010)

利用ISSR技术对老芒麦(ElymussibiricusL.)和紫芒披碱草(ElymuspurpuraristatusC.P)及其杂种F1代与BC1代的遗传差异性进行研究。结果表明，从90个ISSR引物中筛选出8个适宜引物，共扩增出71个ISSR位点，多态性位点比率为36.6%。供试材料的遗传距离变幅为0.230 8～0.659 1，老芒麦与紫芒披碱草的遗传距离较大(0.712 2)，以GD值0.50为基准，分为两类，母本老芒麦、正交F1代、L-BC1、Z-BC1为一类。父本紫芒披碱草、反交F1代为一类，BC1代偏向轮回亲本老芒麦遗传。

老芒麦； 紫芒披碱草； 杂种F1代； BC1代； ISSR

远缘杂交是不同物种间进行基因交流、创造遗传变异的有效途径，目前已成为育种者进行种质创新，选育新品种的重要手段[1-3]。小麦族(Triticeae Dumortier)属于禾本科(Gramineae)，与人类关系十分密切，因其含有栽培小麦所缺乏的抗旱、抗病虫，耐瘠薄、高产、优质等宝贵基因资源，现已成为麦类作物及牧草遗传改良的巨大基因库。小麦族中很多种类既为人们提供优质牧草，又在水土保持、防风固沙等方面发挥重要作用，如披碱草属(Elymus)、偃麦草属(Elytrigia)、冰草属(Agropyron)、大麦属(Hordeum)等[4-8]。紫芒披碱草(ElymuspurpuraristatusC.P)与老芒麦(ElymussibiricusL.)均为小麦族披碱草属(Elymus)的多年生禾草，紫芒披碱草为6倍体，其主要优点是鲜草产量高、不易倒伏、抗病虫、抗旱、耐盐碱，但在饲草品质方面逊于老芒麦；老芒麦为四倍体，具有叶量大、品质优、产籽量高等特点，但植株容易倒伏、种子落粒性强[9]。为使二者的优良性状综合到一起，选育具有草质好、产量高、抗性强等特性的披碱草新种质，近年来笔者将紫芒披碱草与老芒麦相组配进行远缘杂交，成功地获得了正、反交杂种F1代。观察发现，正、反交杂种F1代为五倍体，杂种优势很强，具有较高的育种利用价值，但杂种F1代高度不育，致使其进一步利用受到了限制。为此，用回交方法成功地获得了(老芒麦×紫芒披碱草)×老芒麦和(紫芒披碱草×老芒麦)×老芒麦的回交一代，BC1代的育性得到了一定恢复。

ISSR是建立在PCR反应基础上的一种新型DNA分子标记技术。它能快速、高效地检测出重复序列之间区域的DNA多态性，具有DNA用量少、稳定性高、多态性丰富、成本较低、操作简单等优点。目前已在植物遗传多样性分析、农作物品种鉴定、遗传作图、物种分类及分子标记辅助选择育种等方面得到了广泛应用[10-13]。本试验拟对紫芒披碱草、老芒麦及其杂种F1代和BC1代进行ISSR研究，旨在从分子水平上探讨亲本与其杂交后代间的相似性和遗传差异程度，以期为正、反交F1代与回交BC1代及亲本间的识别和鉴定提供理论依据，同时也为杂交后代的选育利用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料(表1)种植在内蒙古农业大学农作物试验场内、试验地土壤为沙壤质暗栗钙土，肥力适中，具有灌溉条件，无霜期145 d，降水量400 mm左右。

表1 试验材料

注：“L-BC1”表示[老芒麦×紫芒披碱草]×老芒麦回交一代，“Z-BC1”表示[紫芒披碱草×老芒麦]×老芒麦回交一代。

1.2 研究方法

1.2.1 DNA提取与检测

剪取各供试材料的新鲜幼叶0.5 g，利用植物基因组试剂盒对基因组总DNA进行提取，然后取3μL DNA溶液稀释后，再用1.5%琼脂糖凝胶电泳对其质量和浓度进行检测，电极缓冲液为1×TAE Buffer，电源电压为50 V，电泳20 min后，凝胶用核酸染料进行染色，然后用紫外凝胶成像系统仪观察、照相。最后将模板DNA浓度调至20 ng/μL后，保存在冰箱-20 ℃下备用。

1.2.2 ISSR-PCR扩增反应体系

ISSR-PCR扩增反应体系20μL：20 ng/μL模板DNA 1μL、10×Buffer 2.0μL，25 mmol/L Mg2+1.6μL，10 mmol/L dNTPs 0.4μL，10μmol/L引物0.8μL，5 UTaqDNA 聚合酶0.2μL，ddH2O 14μL。PCR扩增程序为94 ℃预变性5 min，1个循环，然后进行40个循环(94 ℃变性45 s，50 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s)，循环结束后，72 ℃延伸10 min，最后4 ℃保存备用。

采用1.5%琼脂糖胶电泳对扩增产物进行检测，电泳缓冲液为1×TAE Buffer，电泳时间1.5 h。电泳结束后凝胶用EB染色，拍照、记录、保存图像。

1.2.3 引物筛选

利用上海生工生物工程技术服务公司合成的ISSR引物，选取紫芒披碱草与老芒麦基因组DNA为模板，对90条ISSR引物进行筛选，对于带型清晰、重复性好的引物用于所有个体扩增。

1.2.4 数据统计及分析

ISSR通常被认为是显性标记，电泳图谱的每条条带都代表引物的一个特异结合位点，按照点样顺序对多态性条带进行逐条比对，将清晰的条带赋值为 1，相同迁移率位置无带或模糊不清的弱带赋值为 0，生成0，1组成的数矩阵，运用DPS分析软件计算供试材料间的遗传相似系数 (GS) 及遗传距离 (GD)，并根据UPGMA方法进行聚类分析[14-15]。

1) 多态性条带百分率(%)=(K/N)×100%，式中K为扩增出多态性条带数目，N为检测到的条带总数。

2) 遗传相似系数(GS) 和遗传距离(GD)：遗传相似系数(GS)=2Nij/(Ni+Nj)，式中Nij是指第i材料和第j材料共同的条带数目，Ni为第i材料中扩增的条带数，Nj为第j材料中扩增的条带数；

遗传距离(GD)=1-GS。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA提取

由图1可以看出，紫芒披碱草、老芒麦及其杂种F1代和BC1代均出现1条带型清晰、无拖尾的条带，表明利用试剂盒提取的基因组DNA纯度较高，无降解，完全符合ISSR试验要求。

2.2 ISSR扩增结果

以老芒麦和紫芒披碱草的基因组DNA为模板，利用90个ISSR引物对供试材料进行PCR扩增，最终筛选出带型清晰、多态性明显、重复性好的引物共8个，占所有引物的8.9%。将这8个引物用于各供试材料的PCR扩增，每个引物扩增条带范围在 7～11条，其DNA片段长度介于250～2 000 bp之间，8个引物共扩增出71条条带，平均每个引物扩增出8.9条，其中多态性条带26条，多态性条带比率为36.6%(表2、图2)，表明在DNA分子水平上供试材料间存在着一定的遗传差异性。从部分引物扩增的ISSR指纹图谱可以看出，老芒麦×紫芒披碱草杂种F1代与回交后代植株及双亲之间的ISSR谱带差异明显，这些引物可作为回交后代与亲本及杂种F1代相互识别和鉴定的依据。

表2 引物序列及位点多态性

引物序列(5’-3’)扩增条带数多态性条带数多态性条带率(%)A05(AG)8C9444．4A07(TG)8RA8337．5A11(AG)8TA10440A49(AC)8RT8225A57(AG)8CC7228．6A99(TC)8C9444．4A123(CT)8RC11545．5A127(GAA)69222．2Total712636．6

注：1为老芒麦；2为紫芒披碱草；3为正交F1代；4为反交F1代； 5为L-BC1；6为Z-BC1。图2 供试材料部分引物 ISSR 扩增结果

2.3 材料间亲缘关系聚类分析

遗传距离(GD)表示2个材料间的遗传差异程度，GD值愈大表明遗传背景差异性越强，亲缘关系越远。供试材料的遗传距离范围在0.230 8～0.659 1之间，平均距离为0.36，说明供试材料间遗传基础较宽(表3)。其中Z-BC1与老芒麦之间遗传距离仅为0.230 8，亲缘关系最近；老芒麦与紫芒披碱草之间遗传距离达到0.659 1，亲缘关系最远，表明亲本间遗传背景具有较强的差异性。

表3 供试材料的遗传距离矩阵

试验材料ABCDEB0．6591C0．41030．5682D0．54550．38780．4545E0．31430．62500．51430．6250F0．23080．56820．53850．43180．4286

注：A为老芒麦；B为紫芒披碱草；C为正交F1代；D为反交F1代；E为L-BC1；F为Z-BC1。

注：A为老芒麦；B为紫芒披碱草；C为正交F1代； D为反交F1代；E为L-BC1；F为Z-BC1。图3 供试材料的ISSR聚类图

从图3可知，当遗传距离为0.50时，供试的6个材料明显地划分为2个类群，一类群含有老芒麦、正交F1代、L-BC1、Z-BC1。另一类群含有紫芒披碱草、反交F1代，各类群内供试材料亲缘关系较近，类群之间遗传关系较远，回交BC1代偏向四倍体老芒麦遗传，表明回交后代与轮回亲本老芒麦有较近的遗传关系。

3 讨论与小结

ISSR分子标记具有很好的多态性、可重复性和稳定性，且不受样品生长发育时期、基因是否表达及环境的影响。能从DNA水平上检测个体间的遗传差异性和相似性，被认为是研究物种亲缘关系及种质资源鉴别的有力工具[16-21]。本试验从90条ISSR 引物中筛选出8条适宜引物对6份材料进行扩增和检测，共扩增出位点71个，其中多态性位点为26个，多态性位点百分率为36.60%，结果表明，亲本与杂交后代间的ISSR位点多态性较丰富，不同引物得到的多态性位点比率不同，且同一引物对6份供试材料扩增出的谱带其数目、大小及位置等存在明显差异，ISSR可作为遗传标记用于杂种鉴定和回交后代目标性状植株选择。

各供试材料的遗传距离分布范围在0.230 8～0.659 1之间，遗传距离最大为亲本老芒麦与紫芒披碱草，最小为Z-BC1与老芒麦；以遗传距离(GD)0.50为基准，将供试材料划分为两类：第一类为老芒麦、正交F1代、L-BC1、Z-BC1。第二类为紫芒披碱草、反交F1代。利用ISSR 标记技术从分子水平上揭示6份供试材料的亲缘关系, 这将为杂种后代的选育提供理论依据。

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ISSR Analysis ofElymussibiricus，Elymuspurpuraristatusand Their Hybrid F1代and BC1

LIXiaolei1，BAOHongchun2，YUZhuo1

(1.College of Agronomy，Inner Mongolia Agricultural University，Hohhot 010019，China； 2. Institute of Horticulture，Inner Mongolia Academy of Agriculture and Husbandary Sciences，Huhhot 010010，China)

The genetic differences amongElymussibiricusL.，ElymuspurpuraristatusC.P，their hybrid F1and BC1were investigated by using ISSR technique. The results showed that 71 loci were amplified from 8 primers out of 90 ISSR primers，the polymorphic loci percentage were 36.6%. The genetic distance (GD) of tested plants were ranged from 0.230 8 to 0.659 1，and the genetic distance ofE.sibiricusandE.purpuraristatuswas ulterior(0.712 2)，using the GD value of 0.5 as threshold，6 tested plants could be clustered into 2 groups：group 1 including female parentE.sibiricusandE.sibiricus×E.purpuraristatusF1、L-BC1、Z-BC1，group 2 including male parentE.purpuraristatus、E.purpuraristatus×E.sibiricusF1，BC1tended to inherit toward recurrent parentE.sibiricus.

Elymussibiricus；Elymuspurpuraristatus； hybrid F1；BC1；ISSR

2016-07-13

国家自然科学基金项目(编号：31302021)及内蒙古自然科学基金项目(编号：2010 MS 0502)资助。

李小雷 (1980—)，男，黑龙江绥化市人；博士，讲师，主要从事饲用作物遗传育种研究。

于 卓(1958—)，男，博士，教授，博导，主要从事饲用作物及马铃薯育种研究。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.12.017

S 543+.9

A

1001-4705(2016)12-0017-04