混合接种外生菌根菌对马尾松种子萌发及幼苗生长的影响

， (.贵州大学农业生物工程研究院/生命科学院，山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室， 贵阳 550025；2.贵州大学林学院， 贵阳 550025)

·研究报告·

混合接种外生菌根菌对马尾松种子萌发及幼苗生长的影响

张婷1,2，文晓鹏1
(1.贵州大学农业生物工程研究院/生命科学院，山地植物资源保护与种质创新教育部重点实验室， 贵阳 550025；2.贵州大学林学院， 贵阳 550025)

采用彩色豆马勃(Pisolithustinctorius)和美味牛肝菌(Boletusedulis)处理马尾松(Pinusmassoniana)种子，探讨外生菌根真菌对马尾松种子萌发、幼苗生长和根系发育的影响。结果表明： 1) 外生菌根真菌伴种后菌根化幼苗的成活率、苗高、地茎、干重、根冠比均有明显提高，但其对种子萌发影响没有达到显著性差异； 2) 根系活力、主根长、总根长、侧根数和根表面积皆显著优于对照，菌根化根系形成了菌套和哈氏网，且根系皮层面积比例明显高于未接种的根系，菌套面积比例与植株株高、地茎呈正相关性； 3) 综合比较的结果是，2种菌根组合处理对促进马尾松幼苗生长的效果最好。

马尾松； 外生菌根； 种子萌发； 幼苗生长； 根系

外生菌根真菌是森林土壤微生物家族中的主要成员，其菌丝侵染宿主植物尚未木栓化的营养根，在幼根表面形成菌套结构，同时延伸进根皮层细胞间隙形成哈氏网，但不进入细胞内[1]。有大量研究证明，外生菌根有利于植物对水分和营养物质的吸收和提高宿主抗性[2]，通常能与松科(Pinaceae)植物形成共生关系，彩色豆马勃(Pisolithustinctorius(Pers.)Coker et Couch)和美味牛肝菌(Boletusedulis(Bull：Fr.)为常见种。

表1 不同处理对马尾松种子萌发的影响

处理初始萌发(d)发芽率(%)发芽势(%)发芽指数活力指数P．t374+6．25a40．67+1．52a15．1+0．26a50．12+2．68aB．e375．33+4．16a42+2a15．5+0．55a52．69+1．36aB．e+P．t372．33+3．05a42．33+3．06a15．81+0．98a55．02+4．85aNECM375+4a41．67+3．06a15．37+1．13a51．9+6．11a

注：表中同一列中有相同字母表示plt;0.05差异不显著。下同。

马尾松(PinusmassonianaLamb.)是重要的用材树种，也是典型的外生菌根共生树种，大量分布在我国南方亚热带土壤贫瘠的森林地区。已经有研究表明，外生菌根在马尾松营养物质的吸收[3]、抗旱性[4]、抗病性[5]、降解土壤污染[6]等方面起重要作用。自然界森林中树木通常被多个外生菌根真菌殖民[7]，然而许多关于菌根的实验都只研究单一菌根菌接种的情况[8]。迄今，对马尾松外生菌根的研究也多集中在接种单一菌根菌[3,5]，尚未见彩色豆马勃和美味牛肝菌组合接种对马尾松种子萌发影响有关方面的报道。本试验探讨了单一菌及混合菌伴种对马尾松种子萌发和幼苗生长及根系特性的影响，旨在为优势互补效应外生菌根真菌的组合配置应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材 料

选自四川眉山市丹棱县杨场镇生长势优良的20年龄的马尾松种子。供试的外生菌根真菌分别为：彩色豆马勃(Pisolithustinctorius，贵州大学植物生理实验室提供)和美味牛肝菌(Boletusedulis，北京农学院曹庆芹教授惠赠)。育苗基质采自贵州贵阳市孟关林场距土表层50 cm下的土壤，pH值为5.08，有机质5.71 g/kg，全氮0.43 g/kg，碱解氮38.38 mg/kg，全磷0.12 g/kg，全钾4.23 g/kg，有效磷1.32 mg/kg，速效钾28 mg/kg，有效铜0.16 mg/kg，有效锌0.53 mg/kg，有效铁4.26 mg/kg，有效锰4.52 mg/kg，有效硼0.062 mg/kg，交换性钙445 mg/kg，交换性镁33 mg/kg，属黄壤粘土，按体积9∶1与河沙混合。喷洒甲醛，闷盖塑料膜1周后，124～126 ℃灭菌1 h，晾晒1 d，重复灭菌1次，另备高温高压灭菌的珍珠岩用作盖土。

1.2 方 法

1.2.1 试验设置

试验处理包括接种彩色豆马勃(P.t)、美味牛肝菌(B.e)及按1∶1混合2种外生菌根真菌(B.e+P.t)，以不接种为对照(NECM)。每盆播种100粒，每处理重复3次，置于贵州大学生物工程研究院温室中培育。

1.2.2 菌种制备和接种处理

2种菌种进行扩大培养，制成菌液菌(改良PDA)以及固体菌(草炭和玉米粉按1∶2混合)，待菌丝长满基质后使用。选择籽粒饱满的马尾松种子，用0.25%高锰酸钾浸种30 min，无菌水冲洗，在25 ℃恒温箱中用45 ℃温水浸种24 h。最后将种子取出用纱布包裹后，置于25 ℃恒温箱催芽，待种子咧嘴露白时播种。将育苗基质与固体菌剂(200 g/盆)拌菌混合装盆，距盆高2/3处基质中喷洒液体菌剂(200 mL/盆)，覆上基质后播种，在种子周围撒上液体菌剂(100 mL/盆)，覆薄土和珍珠岩。对照不接种，仅接入与菌根真菌相同的培养基质。

1.2.3 指标测定与数据处理

对马尾松种子发芽相关指标进行观察记录，接种10个月后，随机抽查菌根化情况并分别测定幼苗的苗高、地茎、成活率、植株干重、根冠比、菌根依赖性、菌根感染率、根系活力；利用WinRHIZO根系分析系统测定主根长、总根长和侧根数；制作菌根石蜡切片，常规石蜡包埋、番红-固绿双重染色[9]，Olympus光学显微镜下观察。

发芽率(%)=正常发芽种子数(终止于第20天)/供试种子总数×100%；

发芽势(%)=达到高峰时发芽种子数/供试种子总数×100%；

发芽指数=∑Gt/Dt (Gt为t日的发芽数，Dt为发芽相对日数)；

活力指数=∑(Gt/Dt)×S，(S为幼苗生长势，用平均根长表示)；

菌根依赖性(%)=(接种干物质量-不接种干物质量)/接种干物质量×100%。

实验数据采用Excel 2007、SPSS 18.0和ActoCAD 2012进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 菌根真菌对马尾松种子萌发的影响

结果表明，无论接种与否，马尾松种子从播种到初始萌发的时间差异不大，大约为3 d。2种外生菌根真菌对马尾松种子萌发无明显作用(表1)，发芽率都在72.33%～75.33%之间，发芽势在40.67%～42.33%之间。从发芽指数和活力指数来看，2种外生菌根真菌混合处理均为最高，但差异均不显著。其可能的原因是，马尾松种子萌发时期所需要的养分几乎都来自胚乳中，外生菌根真菌伴种育苗对种子萌发阶段的影响是有限的，从萌发到幼苗的初始形态建成主要由种子本身的营养状况所决定。

表2 不同处理对马尾松幼苗生长的影响

处理幼苗成活率(%)株高(cm)地茎(mm)地上干重(g)地下干重(g)总干重(g)根冠比(%)P．t53．33+0．89b14．64+0．34b1．38+0．02b0．71+0．01b0．2+0．02b0．92+0．03c28．79+1．6bcB．e54．3+1．27b13．71+0．36b1．34+0．01b0．77+0．03a0．23+0．02a1+0．04b30．43+1．64abB．e+P．t57．29+1．26a16．08+0．77a1．43+0．05a0．81+0．02a0．27+0．02a1．08+0．01a32．92+3．46aNECM49．37+0．63c11．9+0．34c1．27+0．02c0．46+0．04c0．12+0．01c0．59+0．05d26．22+0．72c

注：A、E为P.t菌根；B、F为B.e菌根；C、G为P.t+B.e菌根；D、H为不接种菌根，图中星号示菌套和哈氏网，被染成蓝绿色。(A,B,C,D标尺=30 μm;E,F,G,H标尺=20 μm)。图1 马尾松不同外生菌根横截面菌套、哈氏网的形态结构

2.2 菌根真菌对马尾松幼苗生长的影响

结果，无论单一或混合接种2种外生菌根真菌均不同程度地促进了马尾松幼苗的生长，综合来看(B.e+P.t)组合促生效果最好，B.e和P.t次之，不接种菌根对照NECM则表现最差(表2)。实验表明，接种(B.e+P.t)真菌后播种幼苗的成活率达到57.29%，显著高于NECM对照7.92%；其苗高和地茎也显著(plt;0.05)比对照增长了26%和11.19%。此外，菌根化幼苗的地上和地下干物质积累明显高于不接种对照组，说明外生菌根直接影响了植株地上和地下部分的生物量的分配，特别是B.e和(B.e+P.t)真菌处理组的干物质量显著提高。根冠比是植株生长势的衡量指标，被外生菌根侵染的处理组根冠比都高于NECM对照，说明外生菌根对植物地下根系的作用要高于地上茎、叶部分。参照Plenchette等计算菌根依赖性，发现外生菌根真菌对马尾松幼苗的生长贡献很大，其是典型的外生菌根树种。表明外生菌根真菌的侵染对幼苗生长有显著正向作用。

2.3 菌根真菌对马尾松根系的影响

对菌根化马尾松根系变化特征进行了研究(表3)，发现2种外生菌根真菌对根系形态构建有巨大的影响。通过外生菌根真菌与种子伴种的侵染方式，马尾松幼苗菌根感染率均超过70%，其根系活力水平都显著高于不接种对照，说明外生菌根直接作用于根系，促进了植株对营养的吸收和地上部分的生长。测定根系相关参数发现，接种外生菌根真菌后主根长、总根长、侧根数和根表面积有显著性变化，出现主根变长、侧根数目增加、总根长和根表面积增大的特征，特别是(B.e+P.t)处理组在各项指标中都呈显著性增长(plt;0.05)。表明接种外生菌根真菌对根系生长有直接影响，且混合接种对根系生长的影响显著。

表3 不同处理对马尾松幼苗根系的影响

处理菌根依赖性(%)菌根感染率(%)根系活力(mg/gh)主根长(cm)总根长(cm)侧根数根表面积(cm2)P．t36．25+3．28c76．67b0．39+0．03a12．94+1．81a136．92+12．22b13．33+2．08b16．72+0．92bB．e41．56+2．7b78．33b0．41+0．03a13．82+1．12a141．73+9．47b16．67+2．01ab16．89+0．76bB．e+P．t45．74+4．51a83．33a0．42+0．03a11．94+1．67a158．73+7．32a19．05+1．67a18．12+0．43aNECM——0．32+0．03b7．42+0．91b95．44+5．02c9．33+1．53c13．68+0．63c

表5 菌根化马尾松生长指标的相关性分析

指标株高地茎成活率地上干重地下干重总干重根冠比菌根依赖性根系活力主根长总根长侧根数根表面积中柱皮层菌套株高地茎0．951∗∗成活率0．6260．666∗地上干重0．4400．3800．686∗地下干重0．6040．682∗0．773∗0．795∗总干重0．5310．5250．758∗0．968∗∗0．922∗∗根冠比0．5670．718∗0．6660．4940．919∗∗0．697∗菌根依赖性0．2600．1440．6220．776∗0．4090．6640．079根系活力0．2880．3470．3110．3130．2990．3240．2140．384主根长-0．377-0．198-0．109-0．3490．053-0．2000．325-0．609-0．270总根长0．4330．3330．670∗0．5600．3680．5090．1530．878∗∗0．254-0．624侧根数0．4420．5370．716∗0．840∗∗0．933∗∗0．923∗∗0．799∗∗0．4120．3480．0460．241根表面积0．4480．3510．6490．4800．2990．4300．1040．848∗∗0．288-0．6350．988∗∗0．162中柱-0．713∗-0．513-0．346-0．193-0．045-0．1410．077-0．419-0．0550．671∗-0．6140．135-0．670∗皮层0．713∗0．5130．3460．1930．0450．141-0．0770．4190．055-0．671∗0．614-0．1350．670∗-1．000∗∗菌套0．903∗∗0．820∗∗0．5850．2530．3830．3200．3720．2360．005-0．4190．5370．1890．555-0．820∗∗0．820∗∗

注：“**”表示在0.01水平(双侧)上显著相关,“*”表示在0.05水平(双侧)上显著相关。

表4 马尾松不同菌根横截面各所占比例

处理中柱(%)皮层(%)菌套(%)P．t17．65b82．36a26．28bB．e18．49b81．51a22．56cB．e+P．t17．19b82．81a30．01aNECM23．07a76．93b—

注：菌根处理组的皮层面积包含菌套。

不同外生菌根菌真菌侵染马尾松后，其根系解剖结构发生了一些变化。利用切片经番红-固绿对染后，除中柱外菌套和哈氏网均被染成蓝绿色(图1)。从图1可看出，马尾松皮层组织处形成了明显的菌套结构，其厚薄有一定差异。其中(B.e+P.t)处理组菌套最厚，内部菌丝排列有间隙，外部有外延菌丝；B.e处理菌套稍薄，内部菌丝有明显间隙；P.t处理菌丝排列比较紧密间隙少。所有菌根切片中都观察到哈氏网结构，由内层菌丝从皮层细胞间隙侵入，包裹在皮层细胞外部，不伸入细胞内，且菌丝沿着皮层细胞间隙向四周延伸扩展。不接种NECM处理组没有观察到菌套和哈氏网结构。利用ActoCAD测算出中柱、皮层和菌套结构所占菌根横截面比例(表4)，NECM对照组的中柱面积比例显著性高于所有菌根菌处理组，相反所有菌根菌处理组的皮层面积比例均明显高于不接种对照(plt;0.05)，且(B.e+P.t)处理组菌套面积比例显著性最高。菌根菌形成的菌套和哈氏网结构在一定程度上影响了植株根系的物质交换和生长发育。

2.4 生长指标的相关性分析

菌根化马尾松幼苗的成长指标间具有一定的相关性(表5)。株高与地茎、中柱面积比、菌套面积比呈正相关，而地茎与株高、幼苗成活率、地下干重、根冠比、菌套面积比呈正相关。幼苗成活率与地茎、地上和地下干重、总干重、总根长、侧根数呈正相关，根冠比与地茎、地下干重和总干重呈正相关，菌根依赖性则与地上干重、总根长和根表面积呈正相关。从根系部分来看，总根长与幼苗成活率、菌根依赖性呈正相关，根系侧根数与幼苗成活率、地上和地下干重、总干重、根冠比呈正相关，根表面积与菌根依赖性和总根长呈正相关。从根系横截面积比分析，中柱面积比与株高、根表面积呈负相关，且与主根长呈正相关，而皮层面积比则与此相关性分析结果相反，菌套面积比与幼苗植株、地茎和皮层面积比呈正相关。因此，接种菌根后马尾松地上部分与地下部分的生长相互影响，菌根菌改变根系形态结构，特别是菌套、总根长、侧根数、根表面积的增长，这些指标与株高、地茎、成活率、干物质的积累等具有正相关性。

3 结论与讨论

3.1在低磷黄壤中研究彩色豆马勃(P.t)和美味牛肝菌(B.e)伴种后，发现菌根菌对种子的萌发没有显著性作用，种子的发芽主要靠自身储藏物质，待胚芽脱壳后进行光合作用，马尾松才开始自养进程[10]。在种子萌发过程中，菌根菌没有产生明显的积极影响，主要参与了幼苗生长阶段，特别是缺乏根毛结构的马尾松，需借助外生菌根真菌，形成共生体以更好地适应自然环境进行生长发育。

3.2接种菌根菌的马尾松幼苗，其生长指标比不接种对照均表现出明显增长，说明菌根菌侵染与植株的生长和抗性的提高有关系，这与一些研究者研究结果一致[11]。马尾松地上部分的生长与菌根菌改变马尾松幼苗根系结构是分不开的，主要体现在促进株高、地茎、干物质的积累、根系活力、主根长度、总根长度和侧根数目的增长。菌根解剖结构表明，接种P.t和B.e真菌都能形成拟薄壁组织的菌套和哈氏网，与马尾松根系形成共生体结构，丰富的菌丝更加有利于发挥外生菌根的促生作用[12]。研究发现，菌根皮层面积的改变与中柱恰好相反，增大皮层面积更有利于储存水分和养分，这与Smith等研究结果相似[13]。本研究发现，混合接种P.t和B.e的马尾松幼苗，在地上部分和地下部分的生长发育过程中都表现出显著性优势，特别是根部菌套横截面积比与株高和地茎呈显著性正相关，这与吴小芹在黑松中的研究结果[14]不同，其认为菌套所占比例似乎与生长没有明显相关性。株高和地茎是衡量植株生长势的显著指标，而外生菌根的菌套结构被认为是营养物质储存和交换的场所，混合P.t和B.e接种马尾松形成了更大的菌套面积，从土壤中获得了更多的营养供植株生长，证明了外生菌根真菌间可以形成正向优势互补效应，其比单一接种马尾松幼苗更有效。且混合接种的马尾松根系总根长、侧根数、根系表面积都显著性优于单一接种对照，这样的根系结构更加有利于地上部分的生长、提高幼苗成活率和干物质的积累等，因此P.t和B.e的搭配组合更有利于促进马尾松幼苗的生长。

3.3从实验结果来看，外生菌根真菌的侵染直接作用于马尾松幼苗的生长，并间接影响了土壤微环境和养分的循环利用。P.t和B.e的搭配使用比单独施用效果更好，因此配置适宜的、可持续利用的外生菌根真菌组合，对马尾松商业化育苗栽培及其生产应用具有重要意义。

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[2]Smith S E,Read D J.Mycorrhizal symbiosis[M].Academic press,2010:191-192.

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Effect of Ectomycorrhizal Fungi Combination on Seed Germination and Seedling Growth of Masson Pine (Pinusmassoniana)

ZHANGTing1，2，WENXiaopeng1
(1.The Key Laboratory of Plant Resources Conservation and Germplasm Innovation in Mountainous Region (Ministry of Education),Institute of Agro-bioengineering and College of Life Sciences,Guizhou University,Guiyang 550025,China;2.College of Forestry,Guizhou University,Guiyang 550025,China)

The effects of two ectomycorrhizal fungi, i.e.PisolithustinctoriusandBoletusedulis,on seed germination, seedling growth and root development of masson pine (Pinusmassoniana) were investigated in the present work. The results showed that ectomycorrhizal fungus did not have a statistically remarkable influence on the seed germination. The seedling survival ratio, plant height, stem diameter,dry weight and root/shoot ratio were obviously increased, and the root activity, main root length, total root length, number of lateral root, as well asroot surface area were significantly higher in comparison with that of the inoculation-free (control).Further,mantle and intracortical hartig net were observed from the ectomycorrhizal roots,the ratio of cortex/cross-section of the ectomycorrhizal roots were substantially higher than those of the control,and the plant height and stem diameter were positively correlated with the ratio of mantle/cross-section of the ectomycorrhizal roots.Conclusively,the combination treatment of the two ectomycorrhizal fungi gave the best performance for masson pineseedling growth.

masson pine; ectomycorrhizal fungus; seed germination; seedling growth; root

2016-05-15

国家863子项目(编号：2011 AA 10020301)；贵州省科技重大专项(编号：20126011-1)。

张 婷(1984—)，女，在读博士研究生，研究方向：林木生理生化与分子生物学；E-mail：gyzhangting@163.com。

文晓鹏，博士，教授，主要从事林木生物技术及遗传育种；E-mail：xpwensc@hotmail.com。

10.16590/j.cnki.1001-4705.2016.10.001

S 722.3+9； S 791.248

A

1001-4705(2016)10-0001-05