几种豆科植物抗菌肽的生物信息学预测与分析

邹谋勇，朱新贵*

（李锦记（新会）食品有限公司，广东江门529100）

几种豆科植物抗菌肽的生物信息学预测与分析

邹谋勇，朱新贵*

（李锦记（新会）食品有限公司，广东江门529100）

植物抗菌肽是存在于植物组织细胞中的一类对于对外来侵害有防御作用的小分子蛋白，可抑制或杀伤多种细菌和真菌。随着人们健康意识的提高以及技术手段的进步，植物来源抗菌肽的发掘和应用逐渐成为食品开发领域的重要研究方向。该试验从蛋白数据库中筛选了7种豆科植物的抗菌肽，并对其蛋白序列进行了比对和系统进化树分析，结合生物信息学研究工具对豆科植物抗菌肽的疏水性、拓扑结构域、蛋白空间结构和亚细胞定位进行了预测和分析。结果表明，7种豆科植物抗菌肽序列相似度达到71.94%，均具有8个半胱氨酸保守位点；豆科植物抗菌肽为碱性膜结合蛋白，分布于液泡膜、细胞核膜或者细胞膜上；其3D结构均由一组β-折叠和一个α-螺旋组成，与硫堇、植物防卫素蛋白结构相似。

豆科植物；植物抗菌肽；生物信息学；预测

抗菌肽是一种广泛存在于生物体内，对生物体相应病原体具有抑制或者杀伤效应的小分子多肽。目前已经从植物、哺乳动物、水生动物、昆虫、细菌中发现抗菌肽[1-2]，并已累计发现2 000种以上[3]。近年来，对于抗菌肽的研究日益深入，特别是在食品防腐[4]和动物免疫调节[5-6]方面涌现了系列研究成果。植物抗菌肽是抗菌肽家族的重要组成部分，已报道的植物抗菌肽有硫堇、植物防卫素、脂转移蛋白、几丁质结合蛋白四类抗菌肽[7-8]，现阶段得到公认的作用机制包括4种模型：桶-板模型、毯式模型、环孔模型和凝聚模型，大部分抗菌肽是通过破坏细胞膜来实现其抗菌活性的[9-10]。不同植物合成不同种类的抗菌肽，其作用机制也不尽相同[11]。

豆科植物种子是人类食物和动物饲料的重要植物蛋白质来源，特别是大豆种子的蛋白质占干质量40%以上[12]，其在豆制食品（如豆油、豆奶、豆腐、豆干、豆浆）以及发酵调味食品（如酱油、酱料、腐乳等）中扮演重要角色。随着经济社会不断进步，人们对食品的质量安全要求日益提高，促使食品研究工作者致力于绿色、零添加、天然、健康的食品开发。植物抗菌肽作为来源于植物的抗菌物质，其在食品健康领域的应用前景非常广阔[13-14]。豆科植物抗菌肽的发掘与分析，对于研究豆科植物自带蛋白对调味食品发酵微生物的影响以及对豆科植物抗菌肽的分离提取和应用有重要意义。然而，豆科植物抗菌肽的研究却鲜有研究报道[15-16]。

生物信息学是以数据库庞大数据信息为基础，采用计算机信息处理手段解决遗传数据挖掘、生物进化、分子模拟、药物设计等重要课题[17]。本研究通过生物信息学对豆科植物的抗菌肽进行了序列比对、系统进化树分析，并对其理化特性、信号肽、拓扑结构域、蛋白空间结构和亚细胞结构定位进行了初步预测和分析。

1　材料与方法

1.1材料与试剂

豆科植物抗菌肽蛋白序列来源于Uniprot数据库。采用豇豆抗菌蛋白序列[18]，在Uniprot数据库中进行检索，选取序列相似度达到51.2%以上且来源于豆科植物的蛋白序列进行进一步生物信息学分析。

1.2仪器与设备

生物信息学数据采用ThinkPadE40（0578B31）计算机进行分析，所用生物信息学软件：ClustalX，DNAMAN，Mega4，PyMOL，Endnote；其他数据均采用在线工具进行分析。

1.3试验方法

1.3.1豆科植物抗菌肽多重序列比对

采用Clustal X[19]软件对豆科植物抗菌肽同源序列进行多重比对，并导入DNAMAN软件进行数据整理和输出。

1.3.2豆科植物抗菌肽系统进化树分析

将Clustal X多重序列比对结果导入Mega 4软件[20]，采用邻接法构建系统进化树。Bootstrap值设为1 000，其他参数为默认值。

1.3.3豆科植物抗菌肽生物信息学分析

豆科植物抗菌肽基本理化特性采用蛋白理化特性采用在线工具ProtParam进行分析。抗菌肽信号肽与拓扑结构域分析采用在线分析工具Phobius进行预测。蛋白空间结构采用SWISS-MODEL的自动模式进行同源模建，从数据库中比对筛选相似度最高的蛋白结构作为同源模建模板。蛋白亚细胞结构定位采用在线工具Plant-mPLoc进行预测。

理化特性中总平均疏水度（grandaverage ofhydropathy，GRAVY）为蛋白序列中所有氨基酸疏水值的总和与氨基酸数量的比值，负值越小表示亲水性越好，正值越大表示疏水性越强。

2　结果与分析

2.1豆科植物抗菌肽多重序列比对

从Uniprot数据库检索到来源于7种豆科植物的抗菌肽序列，多重序列比对结果如图1所示，序列相似度达到了71.94%，完全一致的保守氨基酸20个，其中半胱氨酸保守位点8个，可形成4个二硫键，以保持蛋白三级结构的相对稳定。FRANCO O L等[18]对不同植物来源的硫堇（Cp-thionin II）进行了多重序列比对，其主要保守位点与图1显示的保守氨基酸位点基本一致。GARCÍA-OLMEDO F等[21]分析认为植物抗菌肽硫堇具有5种不同的二硫键结合方式，植物防卫素有一种保守的二硫键结合方式（见图2A），豆科植物抗菌肽有4个保守二硫键，空间分布与已报道的植物防卫素（defensin）高度相似，与硫堇I、II型（见图2B）也有一定的相似性。因此从蛋白质氨基酸序列的保守性以及二硫键的结合方式可以推测来自于7种豆科植物的抗菌肽为硫堇或植物防卫素的相似蛋白。

图17　种豆科植物抗菌肽多重序列比对结果Fig.1　Multiple alignment of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

图2　硫堇I、II型二硫键结合方式(A)和植物防卫素二硫键结合方式(B)Fig.2　Disulfide bridge structures of thionin I,II types(A), disulfide bridge structures of plant defensins(B)

2.2豆科植物抗菌肽系统进化分析

由图3可知，赤小豆（Phaseolus angularis）和红豆变种（Vigna angularisvar.angularis）的抗菌肽聚为一支，其亲缘关系较近；那卡豆（Vignanakashimae）和绿豆（Vignaradiata）的抗菌肽聚为一支；豇豆（Vigna unguiculata）和上述4种豆科植物的抗菌肽聚为一支。野生大豆（Glycine soja）和大豆（Glycine max）抗菌肽聚为一支，与上述5种豆科植物存在一定的进化距离。但是从整体的进化距离分析，7种不同豆科植物的抗菌肽的亲缘关系相对较近。

图3　7种豆科植物抗菌肽系统进化树分析Fig.3　Phylogenetic tree analysis of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.3豆科植物抗菌肽理化特性分析

采用在线工具ProtParam对7种豆科植物的抗菌肽蛋白进行理化特性分析，统计结果如表1所示。由表1可知，抗菌肽蛋白分子质量在4.29～6.23u之间，分子大小接近；蛋白等电点（isoelectric point，pI）在8.74以上，大豆和野生大豆的pI较高，分别为9.37和9.54，说明豆科植物抗菌肽均带有一定量的负电荷，为碱性蛋白质。这一结果对后续豆科植物抗菌肽分离纯化方法优化（如等电点沉淀）和应用对象的pH值环境设定有重要指导意义。抗菌肽平均疏水度＜-0.439，最小平均疏水度为-0.706（红豆变种、赤小豆），从疏水度数值特征分析认为7种豆科植物具有一定的亲水性；这一特性使得其可以在绝大部分以水为溶剂的饮料食品或者含水的固体半固体食品中发挥抑菌、杀菌活性，表明其在食品保鲜方面具有较大的应用空间。

表17　种豆科植物抗菌肽的理化特性预测Table 1　Physicochemical properties prediction of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.4几种豆科植物抗菌肽的信号肽与拓扑结构分析

在线分析工具Phobius预测结果如表2所示，赤小豆、红豆、绿豆和那卡豆的信号肽长度相等，氨基酸序列仅有一个位点差异，进一步证实了豆科植物蛋白在进化上的保守性。拓扑结构域分析表明7种豆科植物抗菌肽成熟肽段均为非胞质结构域，结合非胞质结构域的定义和蛋白疏水性分析结果（表1），推断豆科植物抗菌肽为膜结合蛋白。因此在进行豆科植物抗菌肽提取时应当优先考虑将胞质和膜结构分开，进而从膜结构中分离目标蛋白，提高蛋白提取效率。为了更大量获得豆科植物抗菌肽，需从分子生物学角度提高生物反应器目标蛋白的合成量，通过信号肽序列改造或置换实现其穿膜运输，使其分泌到培养液中，以降低后续分离提取难度。

2.5豆科植物抗菌肽3D结构同源模建

表27　种豆科植物抗菌肽的信号肽与拓扑结构分析Table 2　Signal peptide and topological structure of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

由表3可知，大豆和野生大豆抗菌肽与模板硫堇（γ-1-p thionin）的序列相似度为46.81%。绿豆和那卡豆与模板植物防御素（plant defensin）的序列相似度达到100.00%，即可以鉴定为同一蛋白。红豆变种和赤小豆与模板植物防御素的序列相似度为78.26%，豇豆抗菌肽与模板植物防御素的序列相似度为73.91%，可以推断这3种植物抗菌肽与植物防御素高度同源。抗菌肽蛋白和模板相似度的比对结果与系统进化树分析（图3）所示的同源聚类情况基本一致，推测大豆与野生大豆抗菌肽进化方向为硫堇，与其他5种豆科植物的同源蛋白（植物防御素）虽然有较高的序列相似性，但进化方向出现了明显的分支。

表37　种豆科植物抗菌肽同源模建模板Table 3　Homology modeling templates of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

以表3所列蛋白作为模板，采用SWISS-MODEL对豆科植物抗菌肽进行同源模建，绘制蛋白3D图像如图4所示，7种蛋白具有相似的3D结构，均由一组β-折叠和一个α-螺旋组成，大豆抗菌肽和野生大豆抗菌肽空间结构上非常接近，另外5种抗菌肽蛋白空间结构相似性较高。图4（C、D、E、F、G）所示5种植物抗菌肽的空间结构与BROEKAERT W F等[24]展示的植物防御素（Rs-AFP1）非常相近，Rs-AFP1来自于十字花科萝卜种子。结合系统进化树、序列相似度和蛋白3D结构分析，推断豆科植物中存在与植物防御素、硫堇蛋白序列空间结构相似的蛋白质，这类蛋白可能参与了豆科植物抵御病原微生物入侵的生理过程，即为抗菌肽。从空间结构上解析豆科植物抗菌肽，为后续抗菌肽晶体结构解析，蛋白活性位点改造和蛋白稳定性分子改造提供了重要数据基础，同时也为抗菌肽杀菌机制的研究提供了理论参考。

图4　7种豆科植物抗菌肽蛋白的同源模建3D图Fig.4　3D homology modeling of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

2.6豆科植物抗菌肽亚细胞结构定位

采用在线工具Plant-mPLoc对几种豆科植物的抗菌肽进行亚细胞结构定位，结果如表4所示。由表4可知，大豆、赤小豆抗菌肽定位于液泡，野生大豆的抗菌肽定位于细胞核和液泡，红豆变种的抗菌肽定位于细胞核，绿豆和那卡豆的抗菌肽定位于细胞膜和细胞核。结合7种豆科植物抗菌肽的拓扑结构分析，推断抗菌肽位于上述亚细胞结构的膜上。这一结果对于研究植物抗菌肽杀菌机制的进化过程以及建立豆科植物抗菌肽分离提取方案具有参考意义。汪少芸等[16]从豆科植物入手，研究了植物、动物的防御蛋白及其进化趋势，验证了生物功能分子效率与进化趋势相关联的理论。董璐[15]从脱脂大豆中提取了大豆球蛋白碱性抗菌肽（glycinin basic antibacterial peptide，GBAP），并研究了GBAP对大肠杆菌细胞膜的影响，验证了GBAP对冷藏鲜肉中微生物的抑制作用；碱性抗菌肽的提取进一步证实了生物信息学工具预测大豆抗菌肽为碱性蛋白质的准确性。这一研究表明大豆抗菌肽在食品保鲜有重要应用前景，也提示大豆抗菌肽的存在对于以大豆为主要原料的调味食品发酵有重要影响，需要关注发酵过程中大豆抗菌肽含量和性质变化，并评估对发酵微生物生长代谢的影响。

表47　种豆科植物抗菌肽亚细胞结构定位Table 4　Subcellular structure localization of antimicrobial peptides from seven kinds of leguminous plants

3　结论

7种豆科植物的抗菌肽序列相似度为71.49%，具有20个完全一致的氨基酸保守位点；系统进化树分析表明7种不同豆科植物抗菌肽的亲缘关系较近。蛋白理化性质分析表明7种豆科植物均为碱性蛋白质，具有一定的亲水性；拓扑结构分析预测抗菌肽成熟肽段均为非胞质结构域，推测抗菌肽为膜结合蛋白；同源模建表明豆科植物抗菌肽3D结构与硫堇、植物防卫素蛋白结构相似；通过亚细胞结构定位分析认为，7种豆科植物抗菌肽定位于液泡膜、细胞核膜或者细胞膜上，不同种豆科植物的亚细胞结构定位存在差异。豆科植物抗菌肽的序列分析和生物信息学预测为进一步研究豆科植物抗菌肽的分离提取、生理生化性质研究，及其在食品保鲜和食品发酵领域的应用提供了数据基础。

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Bioinformatics prediction and analysis of antimicrobial peptides from leguminous plants

ZOU Mouyong,ZHU Xingui*
(Lee Kum Kee(Xinhui)Foods Co.,Ltd.,Jiangmen 529100,China)

Plant antimicrobial peptides,existing in plant tissue and cell,are micromolecule proteins for resisting foreign invasion.They have the capacity of resisting and killing a variety of bacterium and fungi.With the improvement of health consciousness and advance of technology,exploring and application of plant antimicrobial peptides become an important research aspect in the field of food development.In the test,seven antimicrobial peptides of leguminous plants were screened from protein database,and multiple alignment and phylogenetic tree analysis were conducted.The hydrophobicity,topologicaldomain,protein 3D structure,subcellular structure localization of plant antimicrobial peptides were predicted and analyzed by bioinformatics tools.It showed that the similarity of antimicrobial peptides sequence of seven leguminous plants,which had eight conserved sites of cysteines,was 71.94%.They were alkaline membrane binding proteins which distributed on tonoplast,nuclear membrane or cytomembrane.The 3D structures were constituted by a group of β-sheets and a α-helix,and the structure similarity was found among thionin,plant defensin.

leguminous plant;plant antimicrobial peptides;bioinformatics;prediction

TS202.1

0254-5071（2016）10-0135-05

10.11882/j.issn.0254-5071.2016.10.030

2016-06-18

邹谋勇（1987-），男，硕士研究生，研究方向为调味品发酵技术与产品开发。

朱新贵（1967-），男，博士，副教授，研究方向为调味品科学与技术。