电针神庭、百会对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力和LIM激酶1磷酸化的影响①

吴洁，卓沛元，林云娇,，王露露,，黄佳，林如辉，陶静，柳维林

电针神庭、百会对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力和LIM激酶1磷酸化的影响①

吴洁1,2，卓沛元2，林云娇2,3，王露露2,3，黄佳1，林如辉3，陶静1，柳维林1

目的 探讨电针神庭、百会穴对脑缺血再灌注大鼠海马突触可塑性和学习记忆能力的影响，及其可能的机制。方法雄性Sprague-Daw ley大鼠32只，随机分为假手术组、模型组、电针组、非穴组，每组8只。模型组、电针组、非穴组采用线栓法制备大鼠脑缺血120m in再灌注模型。电针组电针神庭、百会14 d，非穴组电针大鼠双侧胁下非经非穴14 d。采用Morris水迷宫检测学习记忆能力；电镜观察海马区突触形态；Western blotting检测海马LIM激酶1及其磷酸化水平。结果 与假手术组比较，模型组大鼠逃避潜伏期明显增加(t＞6.789,P＜0.01)，穿越平台次数显著减少(t=8.695,P＜0.001)，突触数减少，LIM激酶1总蛋白(t=7.568, P＜0.01)及磷酸化水平下降(t=8.874,P＜0.001)；与模型组比较，电针组大鼠平均逃避潜伏期明显减少(t＞4.938,P＜0.01)，穿越平台次数显著增多(t=-7.891,P＜0.001)，突触数量增多，LIM激酶1总蛋白(t=-6.473,P＜0.01)及磷酸化水平上升(t=-6.579,P＜0.01)。非穴组各项指标与模型组比较无显著性差异(P＞0.05)。结论 电针神庭、百会穴可以改善脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力，可能与LIM激酶1磷酸化水平升高进而改善突触可塑性有关。

脑缺血再灌注；电针；学习记忆；突触可塑性；LIM激酶1；磷酸化；大鼠

[本文著录格式] 吴洁，卓沛元，林云娇，等.电针神庭、百会对脑缺血再灌注大鼠学习记忆能力和LIM激酶1磷酸化的影响[J].中国康复理论与实践,2016,22(11):1246-1251.

CITEDAS:Wu J,Zhuo PY,Lin YJ,etal.Effectsof electroacupuncture atShenting and Baihuion ability of learning andmemory,and LIM-domain containing protein kinase 1 phosphorylation in ratswith cerebral ischemia-reperfusion[J].Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2016,22(11):1246-1251.

据世界卫生组织统计，全球每年有1500万人罹患脑卒中，其中500万人死亡，500万人永久残疾，高达65%患者伴发认知障碍[1-2]。学习记忆障碍是脑卒中后认知障碍的核心症状[3-4]。急性缺血性脑卒中后3个月认知障碍患病率为35%，3年后仍有24.4%患者遗留认知缺损，且每年以8%的速度增长[5]。针刺疗法被认为是脑卒中有效的治疗方法之一，在预防复发和降低脑卒中致残率方面具有重要作用[6-7]。

突触可塑性是学习记忆的物质基础[8-9]。海马是脑缺血的敏感易损区，而CA1区又是学习记忆的主要神经投射区[10]。慢性脑缺血缺氧可造成树突棘大量脱落及结构改变，从而改变突触传递功能，导致学习、记忆及认知缺陷[11]。突触可塑性表现为突触结合的可塑性和突触传递的可塑性，其功能主要表现为长时程增强 (long-term potentiation,LTP)和 长 时 程 抑 制(long-term depression,LTD)现象，这被认为是学习记忆的细胞生物学基础[12]。

LIM激酶1(LIM-domain containing protein kinase 1,LIMK1)蛋白能够通过磷酸化途径调控细胞骨架形成，维持神经系统的生长发育和功能[13]。LIMK1通过抑制肌动蛋白解聚因子/丝切蛋白，使肌动蛋白聚合，促进树突棘形成和维持树突棘形态[14]。在神经细胞中，LIMK1在调控生长锥运动性和轴突生长中发挥重要作用[15]。在培养的海马神经元中，过表达LIMK1蛋白会加速轴突生长发育，下调LIMK1蛋白水平则具有相反的作用[16]。

我们的前期研究显示，电针刺激神庭、百会穴能够改善脑的超微结构，显著改善大鼠学习记忆能力[17]。本研究观察海马区突触微观形态变化及LIMK1总蛋白、磷酸化蛋白表达水平，以探讨可能的治疗机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

32只清洁级健康雄性Sprague-Daw ley大鼠(批号：2007000638342)，体质量(250±30)g，由上海斯莱克实验动物责任有限公司提供，生产许可证号SCXK(沪)2014-0002。由福建中医药大学实验动物中心喂养，许可证号SYXK(闽)2014-001。大鼠分笼饲养，每笼5只。适应性喂养1周后，用随机数字表法将大鼠编号，分为假手术组、模型组、电针组和非穴组，每组8只。实验过程均严格按照国际动物保护和使用指南的规定实施。

1.2 主要试剂和仪器

线栓：广州佳灵生物技术有限公司。LIMK1一抗、Anti-LIM kinase 2(phospho T505)+LIMK1(phospho T508)一抗：ABCAM公司。华佗牌电针治疗仪：苏州医疗用品厂有限公司。Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所。7.0 T小动物磁共振成像分析系统(MiniMR-60 MRI system)：德国 BRUKER公司。H7650型透射电镜、SIS 400万像素电镜CCD相机：日立公司。

1.3 模型制备

术前所有动物均禁食12 h。参考Longa方法[19]，行左侧大脑中动脉栓塞(m iddle cerebral artery occlusion,MCAO)。大鼠10%水合氯醛3m l/kg腹腔注射麻醉，分离并暴露左侧颈外动脉、颈总动脉和颈内动脉；结扎颈外动脉远心端，用动脉夹阻断左侧颈总动脉、颈内动脉血流，用显微剪在距离颈外动脉分叉处1.0mm处剪一小口，将准备好的线栓插入颈外动脉，剪断颈外动脉，使颈外动脉和颈内动脉之间的夹角增大并趋近一条直线，松开颈内动脉夹，线栓从颈外动脉与颈内动脉分叉处插入约18～22mm，有少许阻力为止，造成局灶性脑缺血；暴露伤口，用生理盐水清洗湿润，120m in后轻轻抽出线栓，用电凝笔烧灼颈外断端。检查、清洗手术创口，缝合皮肤。术中注意保暖，使动物肛温维持在(37±1)℃，保持室温25℃左右，直至大鼠重新恢复活动。

假手术组只分离颈外动脉、颈总动脉和颈内动

脉，不结扎和插线栓。

术后，动物白炽灯照射取暖。动物苏醒后观察其体态及行为，进行神经行为学评分；造模24 h后行MRI扫描，判断模型是否成功。

1.3.1 神经行为学评分

大鼠苏醒后，按Longa评分标准[19]，对大鼠的神经功能缺损程度进行评估。0分，无神经功能缺损体征；1分，不能伸展对侧前爪；2分，向偏瘫侧转圈；3分，行走时向偏瘫侧倾倒；4分，不能自发行走，意识丧失。评分为0分和4分的大鼠予以剔除。该评估由一名对本研究不知情的观察者完成。

1.3.2 MRI

造模24 h后，利用小动物磁共振成像分析系统采用RARE序列进行T2W I扫描。扫描参数：TR/TE 4200/35ms，视野32×32mm，矩阵256×256，层数21，层厚1.0mm。脑部未观察到高亮区域的大鼠予以剔除；梗死面积＞20%者纳入实验。

1.4 干预方法

假手术组和模型组手术后回笼饲养，不予任何治疗。

电针组于手术后第1天开始，参考《实验针灸学》[20]取大鼠神庭(前正中线上，在额顶骨缝交界线前方处，向上斜刺2mm)和百会穴(顶骨正中，向后斜刺2mm)，使用华佗牌30号0.5寸毫针，接G6805电针仪，疏密波，频率2 Hz，强度2mA。每次30m in，每天同一时间治疗1次，直至动物被处死，共14 d。

非穴组取大鼠双侧胁下非经非穴(低于胁部，高于髂嵴10～15mm[21])，使用华佗牌30号0.5寸毫针，接G6805电针仪，治疗参数和疗程同电针组。

1.5 Morris水迷宫测试

Morris水迷宫为直径150 cm、高60 cm的圆形水池，水深30 cm，水温(26±2)℃。在第三象限中央放置平台，直径12 cm，低于水面1～2 cm。四周池壁表面光滑整洁，光线四周对称，水池周围参照物从实验开始到结束位置保持不变。

1.5.1 定位航行实验

从术后第10天开始，共进行4 d。实验开始前，将大鼠放置于水池中自由游泳2m in，以适应环境和人的抓握等相关操作。而后将大鼠按逆时针方向依次由第1象限、第2象限、第3象限、第4象限入水点顺序面向池壁放入水中。若大鼠在90 s内找到平台，并且在平台上停留3 s以上，认为大鼠找到平台，由计算机记录大鼠找到平台的时间，即为逃避潜伏期。如果大鼠90 s内未找平台，则将大鼠拖曳至平台上，并在平台上停留10 s，此时潜伏期计为90 s。

1.5.2 空间探索实验

定位航行实验结束后撤掉平台，将大鼠面向池壁放入水中，记录在90 s内大鼠穿过原放置平台区域的次数。

1.6 检测方法

1.6.1 透射电镜观察

各组大鼠分别于干预14 d后，快速断头取脑，取病变侧海马，切成约1×1×1mm的小块放入4%戊二醛中固定，再经3%戊二醛-1.5%多聚甲醛4℃固定4 h，1%锇酸-1.5%亚铁氰化钾固定2 h，PBS漂洗。酒精-丙酮梯度脱水，环氧树脂618包埋剂包埋。超薄切片，厚80 nm，醋酸铀、柠檬酸铅染色；透射电镜80 kV下观察突触形态结构，电镜CCD相机摄影。

1.6.2 Western blotting

海马组织-80℃冰箱保存。取海马组织100mg，加入裂解液1m l和丝氨酸蛋白酶抑制剂PMSF 10μl，研磨均匀后静置30m in，取上清；4℃14 000 r/m in离心5m in，取上清，BCA测定蛋白浓度。样品蛋白变性后，10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl-polyacryl gradient gel electrophoresis, SDS-PAGE)，转移到聚偏二氟乙烯(polyvinylidene Fluoride,PVDF)膜，封闭2 h后，分别加LIMK1一抗(1∶1000)、Anti-LIM kinase 2(phospho T505)+LIMK1 (phospho T508)一抗(1∶1000)、β-actin一抗(1∶1000)孵育，4℃过夜；TBST洗膜，辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶500)室温孵育1 h。将PVDF膜放于图像扫描仪上，避光配置显色液并覆PVDF膜1 min。Image-lab图像分析系统分析。以β-actin为内参，计算目的蛋白相对灰度。

1.7 统计学分析

应用SPSS 20.0统计软件进行统计学分析处理。数据采用(±s)表示，多组间比较采用单因素方差分析，方差齐则两两比较用LSD法，方差不齐则用Games-Howell法。显著性水平α=0.05。

2 结果

2.1 Morris水迷宫

与假手术组比较，模型组大鼠平均逃避潜伏期明显增加(P＜0.01)，穿越平台次数显著减少(P＜0.001)。与模型组比较，电针组大鼠平均逃避潜伏期明显减少

(P＜0.01)，穿越平台次数明显增多(P＜0.01)。非穴组与模型组无显著性差异(P＞0.05)。与电针组比较，非穴组平均逃避潜伏期增加(P＜0.01)，穿越平台次数减少(P＜0.01)。见表1、表2。

表1 各组定位航行实验逃避潜伏期比较(s)

2.2 海马突触

假手术组左侧海马突触数量较多，结构完整。模型组突触数量减少，分布不均，突触间隙增宽。电针组突触结构较完整、清晰，突触间隙减小。非穴组突触结构有所溶解，数量减少。见图1。

图1 各组海马神经元突触超微结构(透射电镜,50000×)

2.3 Western blotting

与假手术组比较，模型组LIMK1总蛋白(T-LIMK1)及磷酸化(p-LIMK1)水平显著下降(P＜0.001)；与模型组比较，电针组T-LIMK1及p-LIMK1水平明显上升(P＜0.01)，非穴组无显著性差异(P＞0.05)；与电针组比较，非穴组T-LIMK1及p-LIMK1水平降低(P＜0.05)。见表3。

表2 各组空间探索实验穿越平台次数比较

表3 各组LIMK 1总蛋白及磷酸化水平比较(相对灰度)

3 讨论

中医学古籍中鲜见中风后认知障碍病名的记载。通过其主要症状，我们将其归为“健忘”和“呆证”，其中认知障碍轻者为健忘，重者为痴呆。健忘、痴呆病位在脑，脑脉痹阻、脑髓失养导致脑髓损伤是缺血性脑卒中发病的主要病机。督脉所属穴位大部分可以治疗脑部疾病，故有“病变在脑，首取督脉”之说。神庭、百会穴均属督脉，是“三阳五会”的穴位，具有疏郁安神、醒脑开窍、益智生慧等功用，可用以治疗脑卒中后的学习记忆功能障碍。

经穴与脏腑密切相关，是沟通经络和临床的纽带。针刺非穴时发生的变化多是机体应激反应，治疗作用不大，提示经穴有特异性效应。倪丽伟等研究表明，针刺能有效改善脑梗死急性期神经功能缺损，醒脑开窍组针刺效应明显优于非经非穴组[21]。Liu等针刺SAMP8小鼠模型，发现与非经非穴组相比，针刺组皮质P53蛋白水平明显上升，提示针刺特定穴位能提高阿尔海默茨病后学习记忆能力[22]。本研究显示，电针神庭、百会穴可明显改善MCAO大鼠学习记忆功能，而电针非经非穴则无此作用。

人脑存在复杂的学习记忆系统。在与学习记忆相关的脑区中，海马的作用特别突出。突触可塑性被认为是学习记忆形成的重要基础[23]。研究表明，电针可以有效促进海马树突棘结构和功能重塑，从而促进脑缺血后学习记忆功能恢复[24]。Ueno等指出，电针治疗可使脑卒中后突触形态得到一定程度修复，从而阻止海马神经元树突棘退变，促进突触重建，改善脑功能[25]。

LIMK是一种丝氨酸/苏氨酸和洛氨酸双重活性蛋白激酶，它的亚型LIMK1主要分布在脑、脊髓、肝等组织。LIMK1对多种细胞的形态学有重要影响，尤其在调节神经元形态和神经突触生长方面的作用更为显著。有研究表明，LIMK1基因敲除小鼠神经元减少、生长锥缺乏和树突形态异常，导致突触结构和树突棘发育异常，且这些小鼠都有不同程度认知障碍[26]。在体外培养的海马锥体神经元中，LIMK1表达可诱导生长锥形成及神经突生长，反映LIMK1对神经元生理功能精确时空调节的特点[27-28]。有研究指出，缺氧通过抑制肠上皮细胞LIMK1磷酸化而引起cofilin磷酸化水平降低及活性增加，导致细胞骨架F-actin解聚，破坏F-actin/G-actin动态平衡[29]。脑卒中后LIMK1磷酸化水平下降，将影响突触形态及学习记忆功能。

综上所述，本研究证实，电针刺激神庭、百会穴可改善脑缺血再灌注大鼠海马突触的微观形态结构，具有神经保护作用。其机制可能是通过上调LIMK1磷酸化水平，促进突触囊泡数量增加，减小突触间隙，从而缓解脑缺血再灌注损伤，改善学习记忆功能。但具体机制还有待进一步研究。

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Effectsof Electroacupuncture at Shenting and Baihuion Ability of Learning and Memory,and LIM-domain Containing Protein K inase 1 Phosphorylation in Ratswith Cerebral Ischem ia-reperfusion

WU Jie1,2,ZHUO Pei-yuan2,LINYun-jiao2,3,WANG Lu-lu2,3,HUANG Jia1,LINRu-hui3,TAO Jing1,LIUWei-lin1
1.College of Rehabilitation Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou,Fujian 350122, China;2.Fujian Key Laboratory of Rehabilitation Technology,Fuzhou,Fujian 350122,China;3.Rehabilitation of Fujian Province Industry Research Institute,Fuzhou,Fujian 350122,China

Objective To investigate the effectof electroacupuncture(EA)at Shenting(DU24)and Baihui(DU20)acupoints on hippocampal synaptic plasticity and learning andmemory function,and its possiblemechanism in ratswith cerebral ischem ia-reperfusion.Methods Thirty-twomaleadult Sprague-Daw ley ratswere random ly divided into sham group(n=8),modelgroup(n=8),electroacupuncture(EA) group(n=8)and non-acupointgroup(n=8).Themodel group,EA group and non-acupointgroup were performed with leftm iddle cerebral artery occlusion(MCAO).The EA group received electroacupuncture at Shenting and Baihui,while the non-acupointgroup received electroacupuncture at two fixed non-acupoints from bilateral ribs,for fourteen days.Then they were tested with MorrisWater Maze test,and their synaptic structure of hippocampalneuronswasobserved with transm ission electronm icroscope.The levelof total LIM-domain containing protein kinase 1(T-LIMK1)and LIM-domain containing protein kinase 1 phosphorylation(p-LIMK1)were detected withWestern blotting.Results Compared with the sham group,the latency increased(t＞6.789,P＜0.01)and the frequence crossing platform decreased(t= 8.695,P＜0.001)in themodelgroup,while the numberof synapse in hippocampalneurons decreased,and the levelof T-LIMK1(t=7.568,P＜0.01)and p-LIMK1(t=8.874,P＜0.001)decreased.Compared with themodel group,the latency decreased(t＞4.938,P＜0.01)and the frequence crossing platform increased(t=-7.891,P＜0.001)in the EA group,while the number of synapses increased,and the level of T-LIMK1(t=-6.473,P＜0.01)and p-LIMK1(t=-6.579,P＜0.01)increased.Therewas no significant difference between the the non-acupointgroup and themodelgroup in all the indices(P＞0.05).Conclusion Electroacupuncture at Shenting and Baihuican improve the ability of learning andmemory in ratswith cerebral ischem ia-reperfusion,whichmay relatewith the increase of LIMK1 phosphorylation and hippo-

cerebral ischemia-reperfusion;electroacupuncture;learning andmemory;synaptic plasticity;LIM-domain containing protein kinase 1;phosphorylation;rats

10.3969/j.issn.1006-9771.2016.11.002

R743.3

A

1006-9771(2016)11-1246-06

2016-05-11

2016-08-26)

1.国家自然科学基金项目(No.81403450)；2.福建省自然科学基金项目(No.2016J01382)。

1.福建中医药大学康复医学院，福建福州市350122；2.福建康复技术重点实验室，福建福州市350122；3.福建省康复产业研究院，福建福州市350122。作者简介：吴洁(1989-)，女，汉族，江西万年县人，硕士研究生，主要研究方向：神经康复与认知科学研究。通讯作者：柳维林(1985-)，男，汉族，湖南衡东县人，讲师，主要研究方向：神经康复与认知科学研究。E-mail:liu_0366@sina.com。

campalsynaptic plasticity.