CD4+CD25+调节性T细胞与Th17细胞在寻常型银屑病中的表达

张玉丽王逸飞张春敏

CD4+CD25+调节性T细胞与Th17细胞在寻常型银屑病中的表达

张玉丽1王逸飞2张春敏3

目的: 检测外周血中CD4+CD25+调节性T细胞(简称Treg细胞)与Th17细胞在寻常型银屑病(PV)中的表达。方法: 34例寻常型银屑病患者，18例正常人作为对照。采用流式细胞术检测外周血中Treg细胞、FOXP3+Treg细胞及Th17细胞的表达水平。结果: PV患者外周血中Treg细胞比例和FOXP3+Treg细胞比例分别为(3.68±1.22)%和(0.53±0.19)%，低于正常对照组的(6.63± 1.00)%和(0.76±0.14)%(P＜0.05)。Th17细胞比例为(2.20±0.78)%，高于正常对照组的(0.65± 0.22)%(P＜0.05)。PV患者外周血中Treg细胞的表达与FOXP3+Treg细胞的表达呈正相关(r＝0.563，P＜0.05)，而Treg细胞的表达与Th17细胞的表达呈负相关(r＝-0.522，P＜0.05)；Treg细胞和Th17细胞二者与PASI评分无相关性，与病程亦无相关性。结论: Treg细胞表达的减少及Th17细胞应答的增强，可能是导致PV免疫失衡的重要原因。

寻常型银屑病； CD4+CD25+调节性T细胞； Th17细胞； Foxp3； PASI评分； 流式细胞术

目前，寻常型银屑病(psoriasis vulgaris，PV)的发病机制尚不清楚，尤其是功能紊乱的效应性T细胞是如何被活化和维持活化状态的机制尚不明确。CD4+T细胞的两个新亚型CD4+CD25+调节性T细胞(简称Treg细胞)和Th17细胞是近年来的研究热点。研究表明Treg、Th17细胞与多种自身免疫性疾病发病密切相关[1，2]。Treg细胞具有免疫抑制和免疫调节两大功能，是机体维持自身免疫耐受的重要组成部分[3]，而新近发现的Th17细胞则是一种重要的促炎性细胞，可通过分泌IL-17诱导多种前炎症细胞因子和趋化因子的释放，参与机体炎症反应[4]。目前检测PV患者外周血中Treg细胞和Th17细胞的比较与分析的报道较少。故本研究中利用流式细胞术，拟对34例PV患者和18例对照组的外周血中Treg细胞和Th17细胞的水平进行比较分析，为探讨Treg细胞和Th17细胞在PV免疫学发病机制中的作用进行初步尝试。

1 材料和方法

1.1 仪器和试剂 流式细胞仪购自美国BD公司，人调节性T细胞荧光抗体标记试剂盒(包括FITC抗人CD4、PE抗人CD25、PE-Cy5抗人Foxp3、同型对照抗体PE-Cy5 Rat IgG2a及Fixation/Permeabilization等)和刺激剂Cell Stimulation Cocktaul购自ebioscience公司；FITC抗人CD3抗体、PerCP抗人CD8a、PE抗人IL-17A抗体及同型对照购自BioLegend公司；刺激剂、人淋巴细胞分离液购自TBD公司；RP-MI1640培养液购自Gibco公司、小牛血清购自四季青；破膜剂FIX＆PERM Kit购自MultiSciences公司。

1.2 研究对象 选择2011年6～10月我院门诊确诊为PV的患者34例，男18例，女16例，年龄19～62岁，平均(36.3±16.7)岁，病程10天～21年，均为PV的进行期，银屑病患者的皮损面积和严重程度按PASI评分为7.6～22.3分，平均(13.5±3.8)分。就诊前一个月未使用糖皮质激素和免疫抑制剂；同时从健康体检中心选取18名正常人作为对照，其中男10名，女8名，年龄20～64岁，平均(40.0±14.2)岁，且一个月内无细菌、真菌、病毒感染，既往无银屑病等免疫相关皮肤疾病史。两组在性别、年龄上无统计学差异(P＞0.05)。所有受试对象均知情同意并经医院学术伦理委员会讨论通过。

1.3 Treg细胞的检测 取新鲜采集的肝素钠抗凝血100μL，加入CD4-FITC和CD25-PE 20μL，4℃避光孵育30 min，缓冲液洗涤1次，加入1 mL破膜剂4℃避光45 min，洗涤2次，加入2μL溶血素4℃避光15 min后加入FoxP3-PE-Cy5、IgG2a-PE-Cy54℃避光30 min，缓冲液洗涤2次，用适量的缓冲液固定，24 h内上流式细胞仪检测。以CD4、CD25设门区分出CD4+CD25+细胞，再测定Foxp3+细胞并以散点图表示，以荧光抗体染色阳性细胞的百分比记录结果。

1.4 Th17细胞的检测 外周血单个核细胞(PBMC)悬液(2×106mL-1)加入24孔培养板内，每孔1mL，加入刺激剂，置培养箱中培养5 h(37℃，5%CO2)。搜集细胞于离心管中，离心弃上清后加入500μL破膜剂，4℃孵育15 min，离心弃上清，收集细胞后分为同型对照管和实验管，分别加入PerCP-CD8a Antibody 5μL，FITC-CD3 20μL，PE-IgG1 5μL，PE-IL-17A 20μL，4℃避光30 min。PBS洗涤后重悬细胞于300 μL洗涤液中，24 h内上流式细胞仪检测。以CD3/ CD8直方图设门区分出CD3+/CD8-细胞，以散点图表示IL-17+细胞，即CD3+CD8-IL-17+细胞群来代表Th17细胞，以荧光抗体染色阳性细胞的百分比记录结果。

1.5 统计学方法 采用SPSS 17.0软件对所有数据进行统计学分析，组间比较采用独立样本T检验，数据以(¯x±s)表示；P＜0.05为有统计学意义；Treg细胞、Foxp3+Treg细胞和Th17细胞的表达水平之间以及与PASI评分、病程的相关性，采用直线相关分析(Pearson)进行分析，P＜0.05为有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血Treg细胞、Foxp3+Treg细胞比例的检测通过流式细胞仪对细胞表面标志及细胞内因子的检测显示，PV患者外周血中Treg细胞的比例为(3.68 ±1.22)%，低于正常对照组(6.63±1.00)%，差异具有统计学意义(P＜0.05)，其中Foxp3+Treg细胞的比例为(0.53±0.19)%，低于正常对照组(0.76±0.14)%，差异具有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

2.2 外周血Th17细胞比例的检测 通过流式细胞仪对细胞表面标志及细胞内因子的检测显示，PV患者外周血中Th17细胞比例为(2.20±0.78)%，高于正常对照组(0.65±0.22)%，差异有统计学意义(P＜0.05)。见表1。

表1 寻常型银屑病组和正常对照组Treg、Foxp3+Treg与Th17细胞的表达率比较 (¯x±s，%)

2.3 相关性分析 PV患者外周血中Treg细胞的比例与Foxp3+Treg细胞的表达呈正相关(r＝0.563，P＜0.05)，而外周血Treg细胞的比例与Th17细胞的比例呈负相关(r＝-0.522，P＜0.05)；外周血中Treg细胞、Th17细胞的比例与PASI评分无相关性(r值分别为0.021、0.080，P＞0.05)，二者与病程亦无相关性(r值分别为0.085、0.178，P＞0.05)。

3 讨论

银屑病发病机制一直是研究的热点。目前认为其发病核心是细胞免疫紊乱，尤其与T细胞密切相关[5]。Treg细胞与Th17细胞均由初始CD4+T细胞分化而来。Treg细胞可由胸腺内发育成熟后直接迁移到外周，也可由外周初始T细胞(Th0)经TGF-β等细胞因子的诱导分化而来，Foxp3是转录因子 forkhead/winged helix家族的新成员，称叉状头/翅膀状螺旋转录因子，它不仅是Treg细胞的重要标志，而且也参与Treg细胞的分化与功能。Treg细胞通过分泌细胞因子或细胞接触两种方式发挥免疫抑制和免疫调节作用，在维持自身免疫耐受中发挥重要作用；小鼠Th17由初始CD4+T细胞在TGF-β和IL-6等细胞因子的诱导下分化而来(人Th17则由IL-1β和IL-6共同诱导)。Th17细胞则是一种重要的促炎性细胞，其高表达IL-17，同时也分泌IL-6和TNF-α，其中IL-17是 Th17的标志性细胞因子，具有强大的致炎性[6]，Th17细胞具有不同于其它细胞亚群的独立的分化和发育调节机制，在感染性疾病和自身免疫性疾病中发挥着重要的调节作用。

银屑病是一种在一定遗传背景下，效应性T细胞介导的免疫紊乱性炎症性皮肤病[7]。由于免疫反应中Treg细胞功能与效应性细胞功能之间的平衡对免疫反应的维持非常重要，而银屑病的病理特点就是自身反应性T细胞的持续激活，提示寻常型银屑病可能有Treg细胞功能的障碍。Sugiyama等[8]研究发现PV患者外周血和皮损中Treg细胞不仅数目明显低于正常人，而且还存在增殖缺陷，Bovenschen[9]等认为，在外周血中，Treg细胞的数量与正常人相似，但其对效应T细胞的抑制功能明显减弱，陈凌等[10]研究发现，银屑病外周血中Treg细胞不仅比例明显减少，而且其功能也有所降低，不能很好的抑制效应T细胞的扩增和功能。本研究结果显示，PV患者Treg细胞和Foxp3+Treg细胞在人外周血中的表达显著低于正常人，这与陈凌研究结果是一致的。并且Treg细胞的表达水平与Foxp3+Treg细胞的表达水平呈正相关，因此我们认为，可能由于Foxp3+Treg细胞数量减少或功能的降低，导致整个Treg细胞表达水平的降低，使得Treg细胞的免疫抑制和免疫调节功能受到抑制或破坏，导致抑制炎症反应的作用低于正常水平，导致PV的发生。

Capron等[11]的研究结果表明，在中、重度斑块型银屑病的患者外周血中，IL-17表达水平明显增高，且与PASI评分呈线性正相关，LI等[12]实验证明:银屑病患者皮损中IL-17mRNA及Th17细胞相关因子IL-23p19、IL-23p40、IL-6 mRNA含量显著高于患者非皮损处。IL-23是IL-17大量产生的重要细胞因子；IL-6不仅是Th17细胞分泌的炎性介质，同时IL-6又能剂量依赖性促进IL-17的分泌，这种正反馈作用可能参与银屑病等慢性炎症的恶化。本研究结果显示，与正常人比较，PV患者外周血中Thl7细胞的表达率显著增加。由此我们推测Th17细胞可能通过IL-17的促炎效应，或通过其分泌的细胞因子诱导其它细胞产生致炎因子，加重机体的病理性免疫应答反应，参与并促进PV的发生发展。

Beriou等[13]研究发现一群 Foxp3+RORγt+T细胞，这群细胞在炎症反应发生之前就存在着，并抑制T细胞的抗炎症效应，而一部分记忆性Foxp3+Treg细胞高表达Th17细胞的特异性标记RORγt，分泌IL-17，并且其表型与功能和Th17细胞出现部分重合。这表明Treg在某些特定微环境中可能存在着细胞转化。本研究结果显示，PV患者外周血中Treg细胞表达低于正常对照组，而Th17细胞表达高于正常对照组，并且我们的实验研究已证实Treg细胞占CD4+T细胞的比例与Th17细胞占CD4+T细胞的比例呈负向相关，由此我们推测由于Treg细胞和Th17细胞之间的平衡发生了紊乱，且明显向Th17方向偏移；Treg细胞数量的减少或功能的降低，不足以抑制Th17细胞的过度活化，导致PV的发生或加重。

Treg细胞和Th17细胞的分化存在着密切联系，有研究者认为机体内除了Th1/Th2平衡外，还存在Th17/Treg平衡[14]。Th17/Treg失衡可加重疾病的炎症反应。本实验结果显示，在PV患者外周血中Treg细胞表达减少，Th17细胞应答增强，并且二者成负相关，可能是导致PV免疫失衡的重要原因。

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·病例报告·

图1 下肢水疱，丘疹，结痂 图2 足部白色丘疹样瘢痕 图3 棘层变薄，真皮浅层血管增生，轻度单一核细胞浸润(HE，×100) 图4 表皮细胞间及基底膜IgG、C3、IgM、IgA阴性(DIF，×100)

图5 双下肢米粒至黄豆大小丘疹，水疱 图6 结痂以及瘢痕 图7 表皮轻度角化过度及萎缩，裂隙形成，基层液化周围少许单一核细胞(HE，×100)

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(收稿:2014-03-30)

Role of CD4+CD25+regulatory T cells and Th17 cells in patients w ith psoriasis vulgaris

ZHANG Yuli1，WANG Yifei2，ZHANG Chunmin3.
1.Liaocheng People's Hospital，Liaocheng 252000，China；2.Shandong University School ofMedicine，Jinan 250014，China；3.The Second Hospital ofShandong University，Jinan 250033，China

Objective:To detect the expression of Treg cells and Th17 cells in the patientswith psoriasis vulgaris(PV).M ethods:Thirty-four PV and 18 healthy controlswere enrolled in the study，and Treg cells，Foxp3 and Th17 cells of the blood were detected by flow cytometry.Results:The percentage of Treg cells and Foxp3 cells were(3.68±1.22)%and(0.53±0.19)%，which were significantly lower than those in normal controls(6.63±1.00)%，and(0.76±0.14)%(P＜0.05).The percentage of Th17 cellswas(2.20±0.78)%，which was significantly higher than that in normal controls(0.65±0.22)%(P＜0.05).The expression of Treg cells and FOXP3+Treg cellswas positively correlated(r＝0.563，P＜0.05)，but the expression of Treg cells and Th17 cells was negatively correlated(r＝-0.522，P＜0.05).The correlationa mong Treg cells，Th17 cells，PASIscore and duration of the diseasewas not significant(P＞0.05).Conclusion:The decrease in the expression of Treg cells and the increased response of Th17 cellsmay be the important factors for the immunological imbalance in PV.

psoriasis vulgaris；regulatory T cells；Th17 cells；FOXP3；PASIscore；flow cytometry

1.聊城市人民医院山东聊城，252000 2山东大学医学院，山东济南，250014 3山东大学第二医院，山东济南，250033

张春敏，E-mail:cmzhang1878@163.com