TL1A及其受体DcR3在寻常型银屑病皮损中的表达

张丽芳 盛晚香 缪泽群 宋继权

TL1A及其受体DcR3在寻常型银屑病皮损中的表达

张丽芳 盛晚香 缪泽群 宋继权

目的: 检测TL1A及其受体DcR3在寻常型银屑病患者皮损组织中的表达。方法: 采用免疫组织化学法和实时荧光定量RT-PCR法对30例寻常型银屑病患者皮损中TL1A和DcR3水平进行检测。结果: 银屑病组中TL1A和DcR3蛋白阳性表达率分别为93.3%和90%，正常对照组中TL1A和DcR3蛋白阳性表达率分别为20%和60%；银屑病组TL1A mRNA和DcR3mRNA表达CT值分别为4.909±1.607和3.430±1.449，正常对照组TL1AmRNA和DcR3mRNA表达CT值分别为1.250±0.650和1.011±0.150，银屑病组中TL1A和DcR3蛋白及mRNA水平明显高于正常对照，差异均有统计学意义。银屑病皮损中TL1A与DcR3的表达以及TL1A mRNA与DcR3 mRNA蛋白的表达均呈正相关性(r＝0.735，P＜0.01和r＝0.2436，P＞0.05)。结论: TL1A和DcR3可能参与银屑病炎症的发生机制。

寻常型银屑病； 肿瘤坏死因子样配体1A； 诱骗受体3

目前认为银屑病是一种在多种内外环境因素影响下由多基因遗传背景控制的T细胞功能异常的免疫性疾病，涉及到免疫、炎症、细胞增殖与凋亡、微血管异常等多方面原因，其发病机制尚未完全明了[1]。本文通过检测银屑病皮损中TL1A和DcR3的表达情况，进一步探讨银屑病的发病机制。

1 材料与方法

1.1 研究对象 30例寻常型银屑病患者，其中男17例，女13例；年龄11～65岁，平均36.5岁；病程3个月～20年，平均5.8年；所有患者近2个月内未系统应用维A酸、糖皮质激素、免疫抑制剂等药物，2周内未使用任何外用药物及接受光疗，女性患者排除妊娠哺乳期、月经期。15例正常对照来自皮肤科及本院整形外科，其中男7例，女8例，年龄18～60岁，平均28.6岁。银屑病患者的皮损面积和严重程度按PASI评分为8～24.2，平均17.697±4.547。每一例活检标本均一分为二，一份经10%中性福尔马林液固定24 h，常规石蜡包埋用于免疫组化实验；另一份装入冻存管中液氮保存，用于RT-PCR实验。

1.2 试剂 兔抗人TL1A多克隆抗体，兔抗人DcR3多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司，免疫组化SP试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，TL1A抗体工作浓度为1∶50，DcR3抗体工作浓度为1∶50。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化SP法 将组织蜡块作4μm厚连续切片，分别做常规HE染色和免疫组化染色。具体操作步骤严格按照试剂盒说明进行。阳性结果为阳性染色定位于细胞浆或细胞间连接处，并出现黄色或棕褐色的细小颗粒着色。光镜下随机选取高倍视野5处，采用双评分方法:根据染色强度评分:无显色为0分，浅棕黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。根据阳性细胞所占的百分率评分:阳性细胞率≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，≥51%为3分。双盲法独立检测的两次结果取平均值，两种评分的平均值之和为其最终评分。1～2分判为“+”，3～4分判为“++”，5～6分判为“+++”。以(+)者为弱阳性、(++)为阳性、≥(+++)为强阳性表达。

1.3.2 实时荧光定量RT-PCR法 PCR试剂盒购自南京诺唯赞生物科技有限公司。RNA提取按照试剂盒操作步骤采用Trizol法提取RNA，提取后用紫外分光光度计测定OD260/OD280比值，该值在1.8～2.0之间提示纯度满足实验要求。引物序列由北京擎科新业生物技术有限公司合成，使用引物设计软件Primer 5.0辅助设计。引物序列:TL1A:上游引物序列CAAGTCTGTATGCGAAGTAGGT，下游引物序列AAGAAGGCTCCAAAGAAGGT，扩增片段长度为156 bp。DcR3:上游引物序列CTCAATGTGCCAGGCTCTTC，下游引物序列 CCTGGAAAGCCACAAAGTCG，扩增片段长度为 127 bp。β-actin:上游引物序列AGCGAGCATCCCCCAAAGTT，下 游 引 物 序 列GGGCACGAAGGCTCATCATT，扩增片段长度为285 bp。按照说明书操作，反应条件:50℃ 2 min，95℃ 10 min；95℃30 s，60℃30 s，40个循环。行溶解曲线，最终采用2-△△Ct法计算TL1A及DCR3的相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS 20.0软件进行数据分析，计量资料以¯x±s表示，计量资料均数比较采用独立样本t检验，计数资料比较采用四格表卡方χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。TL1A、DcR3与PASI评分的相关性，TL1A与DcR3间表达相关性分析采用Spearman等级相关分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TL1A的表达 TL1A在正常皮肤未见明显表达，极少可见微弱的免疫反应定位于基底角质形成细胞，但在深层真皮或血管周围是完全缺失的(图1a)。与之形成鲜明对比，在银屑病皮损中TL1A表达于表皮内全层细胞、炎性浸润细胞胞浆及真皮小血管周围，以阳性和强阳性为主(图1b)。银屑病患者组TL1A阳性表达明显高于正常对照组(χ2＝21.787，P＜0.01)。见表1。

表1 TL1A、DcR3在银屑病皮损和正常皮肤中的阳性表达情况 例(%)

2.2 DcR3的表达 在大多数正常皮肤中可检测到DcR3的表达，主要位于除角质层以外的表皮各层角质形成细胞的胞质中。另外，在血管周围区域，也可见到DcR3的微弱表达(图2a)。在银屑病组中DcR3表达主要以表皮内细胞胞浆、真皮乳头层及血管周围区域为主(图2b)。DcR3在银屑病皮损中的表达明显高于正常对照组(χ2＝3.906，P＜0.05)。见表1。

2.3 RT-PCR 见图3、4。银屑病组TL1A mRNA与DcR3 mRNA表达CT值分别为4.909±1.607和3.430 ±1.449，正常对照组TL1A mRNA与DcR3 mRNA表达CT值分别为1.250±0.650和1.011±0.150，两组比较银屑病组TL1A与DcR3的基因表达水平均明显高于正常对照组(P＜0.01)(表2、图5)。

表2 TL1A mRNA与DcR3 mRNA在银屑病皮损和正常皮肤中的定量表达(¯x±s)

图1 TL1A在正常皮肤(1a)及银屑病皮损(1b)中的表达(SP，×100)

图2 DCR3在正常皮肤(2a)及银屑病皮损(2b)中的表达(SP，×100)

图3 TL1A mRNA在寻常型银屑病皮损组织和正常皮肤组织中的表达(1～6为正常人，7～13为寻常型银屑病患者)

图5 TL1AmRNA、DcR3mRNA在银屑病皮损组织及正常组织中的表达

2.4 相关性分析 运用Spearman等级相关性分析显示:银屑病皮损中TL1A与DcR3的蛋白表达呈正相关性(r＝0.735，P＜0.01)，见表3。银屑病皮损中TL1A mRNA与DcR3 mRNA表达水平之间及它们分别与PASI之间的相关性分析，见表4。

表3 银屑病皮损中TL1A与DcR3的相关性

表4 银屑病组皮损TL1AmRNA、DcR3mRNA与PASI及TL1A mRNA与DcR3 mRNA间相关性分析

3 讨论

有大量研究表明，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factorα，TNF-α)作为一种促炎症性细胞因子，在银屑病炎症反应、免疫-信号传导及新型治疗等方面都起到了关键性的作用，这提示家族中的其它成员也可能参与慢性皮肤炎症反应[2，3]。

肿瘤坏死因子样配体1A(TNF-like ligand 1 aberrance，TL1A)与TNF-α同属于TNF超家族成员，是一种内皮衍生的T细胞共刺激因子，TL1A不仅能抑制肿瘤生长，诱导细胞凋亡，还具有独特的Th1极化特性，通过与其受体DR3或DcR3的结合，增加辅助性T细胞因子分泌的生理学活性，为T细胞的活化提供第二信号。同时TL1A还能够增强Th1和Th17细胞的分化和增殖，Th17细胞主要分泌IL-17、IL-22、IL-23和TNF-α等细胞因子，其中IL-17具有很强的促炎症作用，在多种自身免疫性疾病及慢性炎症反应性疾病中都有丰富的表达[4，5]。目前认为细胞因子、炎症介质及多种免疫活性物质的共同参与在银屑病的发病和持续反复发作过程中起关键作用，而TL1A与银屑病的相关报道很少，Bamias等利用免疫组化和定量RT-PCR技术首次发现并证实银屑病皮损中TL1A及其受体DR3、DcR3蛋白水平和mRNA表达水平比正常皮肤增高，提示TL1A参与了银屑病的病理过程[6]。本实验通过免疫组化和RT-PCR的方法，对银屑病皮损进行研究，结果显示TL1A无论在蛋白还是mRNA水平都有明显的高表达，与正常对照组相比较差异有显著性意义，这与Bamias等的研究结果相符合。因而它极有可能在银屑病的免疫反应及其慢性炎症反应过程中发挥作用。

诱骗受体3(decoy receptor3，DcR3)是近年来发现的一种新型免疫分子，是属于肿瘤坏死因子受体(TNFR)超家族成员。目前已知DcR3的配体主要有:FasL、LIGHT、TL1A，它与这3种配体的亲和力依次为:TL1A＞FasL＞LIGHT[7]。DcR3与DR3竞争结合TL1A，可以抑制T细胞的凋亡，调节T细胞向Th2分化，抑制致炎细胞因子分泌，降低IL-2的反应性活性。另外它与TL1A相互作用能上调MMP-2mRNA的水平及酶活性，在体内促成新生血管的生成[8]。DcR3通过NF-кB依赖途径上调ICAM-1、VCAM-1和IL-8的表达，增加单核细胞对内皮细胞的黏附性，吸引大量炎症细胞在皮肤损害处聚集[8]。目前DcR3在消化系统肿瘤、肺癌、泌尿系统肿瘤、妇科肿瘤及内分泌肿瘤中的研究已有较多报道[9]。在类风湿关节炎[10]、克罗恩肠病[11]、系统性红斑狼疮[12]及急性呼吸窘迫征中[13]，亦发现DcR3表达增高现象。DcR3与银屑病的关系在国外也有报道，Wu等利用ELISA和免疫组化发现银屑病患者血清和皮损中DcR3蛋白水平表达增高，表明DcR3可能参与了银屑病慢性炎症及血管生成的过程[7]。同时也说明DcR3非肿瘤细胞所特有，在银屑病这种角质形成细胞过度增殖性疾病中亦存在表达。本实验表明，DcR3在正常皮肤与银屑病皮损中均表达，二者比较差异有显著意义。由此推测银屑病皮损中真皮浅层新生血管的生成及慢性炎症的过程可能是DcR3阳性表达增高的结果。

TL1A与 DcR3在银屑病皮损组织中共表达上调，提示两者之间可能以协同或互补的方式共同促进银屑病的发生发展过程。银屑病患者皮损中DcR3 mRNA水平与PASI呈正相关趋势(P＜0.05)，提示DcR3与银屑病的活动性有一定的相关性。本实验通过对TL1A、DcR3在银屑病中的表达特征及相互关系的研究证实了两者在银屑病的发生发展过程中都发挥了重要作用，这也为TL1A、DcR3应用于银屑病的基因治疗及生物治疗提供了理论依据。由于条件所限，本研究所涉样本量小，且尚未对银屑病发病过程中的各个时期及非皮损处TL1A及DcR3的表达进行对照研究，在今后的研究中应扩大样本量并充实研究内容，并从分子学水平研究其在银屑病皮损中的异常表达。

[1]Das RP，Jain AK，Ramesh V.Current concepts in the pathogenesis of psoriasis[J].Indian JDermatol，2009，54(1):7-12.

[2]Li L，Fu L，Lu Y，et al.TNF-like ligand 1A is associated with the pathogenesis of psoriasis vulgaris and contributes to IL-17 production in PBMCs[J].Arch Dermatol Res，2014，306(10):927-932.

[3]范斌，李斌.肿瘤坏死因子α与银屑病[J].中国皮肤性病学杂志，2005，19(6):374-375.

[4]Pedersen AE，Schmidt EG，Sorensen JF，et al.Secretion，blood levels and cutaneous expression of TL1A in psoriasis patients[J].Apmis，2015，123(7):547-555.

[5]Aiba Y，Nakamura M.The role of TL1A and DR3 in autoimmune and inflammatory diseases[J].Mediators Inflamm，2013，2013:258164.

[6]Giorgos B，Kostas E，Theognosia V，et al.Upregulation and nuclear localization of TNF-like Cytokine 1A(TL1A)and its receptors DR3 and DcR3 in psoriatic skin lesions[J].Ex-perimental Dermatology，2011，20(9):725-731.

[7]Wu NL，Huang DY，Hsieh SL，et al.EGFR-driven up-regulation of decoy receptor 3 in keratinocytes contributes to the pathogenesis of psoriasis[J].Biochimica Et Biophysica Acta -Molecular，2013，1832(10):1538-1548.

[8]Yang CR，Hsieh SL，Teng CM，etal.Soluble decoy receptor 3 induces angiogenesis by neutralization of TL1A，a cytokine belonging to tumor necrosis factor superfamily and exhibiting angiostatic action[J].Cancer Research，2004，64(3):1122-1129.

[9]Lin WW，Liang HS.Decoy receptor 3:A pleiotropic immunomodulator and biomarker for inflammatory diseases，autoimmune diseases and cancer[J].Biochem ical Pharmacology，2011，81(7):838-847.

[10]Siakavellas SI，Sfikakis PP，Bamias G.The TL1A/DR3/ DcR3 pathway in autoimmune rheumatic diseases[J].Sem in Arthritis Rheum，2015，45(1):1-8.

[11]Bamias G，Kaltsa G，Siakavellas SI，et al.Differential expression of the TL1A/DcR3 system of TNF/TNFR-like proteins in large vs.small intestinal Crohn's disease[J].Dig Liver Dis，2012，44(1):30-36.

[12]Chokdeemeeboon C，Ammarinthnukrowh P，Tongkobpetch S，et al.DcR3 mutations in patients with juvenile-onset systemic lupus erythematosus lead to enhanced lymphocyte proliferation[J].JRheumatol，2013，40(8):1316-1326.

[13]Chen CY，Yao YK，Yu CM，et al.Decoy receptor 3 levels in peripheral blood predict outcomes of acute respiratory distress syndrome[J].Am JRes CriCare Med，2009，180(8): 751-760. (收稿:2016-05-31 修回:2016-08-26)

Expression of TL1A and its receptor DcR3 in the skin lesions of psoriasis vu lgaris

ZHANG Lifang，SHENGWanxiang，MIAO Zequn，SONG Jiquan.
Department of Dermatology，Zhongnan Hospital，Wuhan University，Wuhan 430071，China Corresponding author:SHENGWanxiang，E-mail:shengwanxiang@126.com

Objective:To investigate the expression of TNF-like ligand 1 aberrance(TL1A)and its receptor decoy receptor3(DcR3)in the skin lesions of the patients with psoriasis vulgaris(PV).M ethods: The expression of TL1A and DcR3 in the skin lesions of 30 patientswith PV was tested with SP immunohistochemical and real-time fluorescence quantitative RT-PCRmethod.Results:The positivity rates of TL1A and DcR3 proteinswere 93.3%and 90%in PV，and were 20%and 60%in the normal samples.The expression levels of TL1A mRNA and DcR3 mRNA were(4.909±1.607)and(3.430±1.449)in PV，and(1.250± 0.650)and(1.011±0.150)in normal skin.The level of TL1A and DcR3 protein and mRNA were significantly higher in PV than that in normal tissue，with a significant difference.There was a positively correlation between the protein level of TL1A and DcR3 in PS(P＜0.01)；TL1A mRNA and DCR3 mRNA expression in psoriatic lesion was a positive correlation(P＜0.05)；TL1A mRNA expression in PSand PASIshows no correlation(P＞0.05)；DcR3 mRNA expression in PS was positively correlation with PASI(P＜0.05). Conclusion:TL1A and DcR3may participate in the pathogenesis of chronic skin inflammation in psoriasis.

psoriasis vulgaris；TNF-like ligand 1 aberrance；decoy receptor3

湖北省自然科学基金项目(编号:2014CFB360)

武汉大学中南医院皮肤科，湖北武汉，430071

盛晚香，E-mail:shengwanxiang@126.com