树脂法分离纯化倒提壶生物碱的研究

樊轻亚，张宏辉，王万好

(1.信阳职业技术学院 药学院，河南 信阳 464000；2.河南同源制药有限公司，河南 信阳 464000)



树脂法分离纯化倒提壶生物碱的研究

樊轻亚1*，张宏辉1，王万好2

(1.信阳职业技术学院 药学院，河南 信阳 464000；2.河南同源制药有限公司，河南 信阳 464000)

采用阳离子交换树脂和大孔吸附树脂联用的方法，将倒提壶生物碱提取液依次经过阳离子交换树脂和两次大孔吸附树脂，对其中的天芥菜碱和毛果天芥菜碱进行分离纯化。结果表明，倒提壶生物碱溶液采用阳离子交换树脂经过水洗和NaCl洗脱与大孔吸附树脂两次经乙醚和50%乙醇洗脱后，毛果天芥菜碱与天芥菜碱的纯度分别从0.73%和2.2%提高至81.6%和79.2%，提取量分别由4.6 mg/g和10.7 mg/g提高至50.6 mg/g和92.7 mg/g。该文所建立的分离纯化方法具有成本低、污染小、周期短、操作简便和分离纯化效率高等特点，适合工业化生产。

阳离子交换树脂；大孔吸附树脂；倒提壶生物碱；天芥菜碱；毛果天芥菜碱；分离；纯化

倒提壶(CynoglossumamabileStapfetDrumm)是紫草科琉璃草属植物，分布于不丹及中国的西藏、云南、贵州、四川等地。倒提壶全草入药，其味苦、性凉，有清热利湿，散瘀止血、止咳、镇痛之功效。倒提壶可内服或外用，常用以治疗疟疾、肝炎、痢疾、咳嗽、风湿性关节炎、尿道炎等症[1-3]。生物碱为本属植物的主要成分，具有广泛的药理活性，如抗肿瘤、抗菌、抑制微生物等。刘清华等[4]对天芥菜碱和毛果天芥菜碱的药理活性作了大量研究。

20世纪70年代末，树脂吸附逐渐用于天然药物有效成分的提取分离，由于其物理化学稳定性高，吸附选择性独特，再生简便，使用周期长，宜于构成闭路循环，节省费用等诸多优点，在中药有效成分的提取分离方面迅速得到广泛运用，并成功地用于生物碱、黄酮、皂苷等多类成分的提取纯化[5-17]。

图1 天芥菜碱(A)和毛果天芥菜碱(B)的化学结构Fig.1 Chemical structures of heliotrine(A) and lasiocarpine(B)

本文采用大孔吸附树脂分离纯化倒提壶提取液中的生物碱成分，通过比较不同类型树脂的性质，研究了pH值、上样液浓度、洗脱剂类型对分离纯化的影响，并采用高效液相色谱(HPLC)法对天芥菜碱和毛果天芥菜碱(结构式见图1)含量进行分析，研究了树脂的吸附和解吸附性能，获得了适合天芥菜碱和毛果天芥菜碱的分离纯化工艺。

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与材料

DFY-200摇摆式高速中药粉碎机(温岭市大德中药机械有限公司)；B-260型恒温水浴(上海雅荣生化设备仪器有限公司)；SHZD(A)型循环水真空泵(天津华鑫仪器厂)；AY-120电子天平(日本Shimaduz公司)；CR3i紧凑型离心机(德国Thermo Scientific公司)；Agilent 1200高效液相色谱仪(美国Agilent公司)。

天芥菜碱、毛果天芥菜碱对照品(纯度98.5%，成都普瑞法科技开发有限公司)；盐酸、氢氧化钠、无水乙醇、乙酸、甲醇、氯仿、乙醚、氨水(分析纯，郑州德众化学试剂厂)；甲醇、乙腈(色谱纯，美国Merck 公司)；倒提壶(安徽亳州市药材有限公司)经信阳职业技术学院中药鉴定学教研室吴长忠老师鉴定为倒提壶(CynoglossumamabileStapfetDrumm) 全草；001×732阳离子交换树脂(蚌埠市辽源新材料有限公司)；BS-65，BS-30，CAD-45，D101大孔吸附树脂(蚌埠市辽源新材料有限公司)；HPD-400树脂(沧州宝恩吸附材料科技有限公司)；实验用水为去离子水。

1.2 实验方法

1.2.1 树脂的预处理 阳离子交换树脂于水中浸泡24 h后取出，置于2 mol/L HCl溶液中浸泡4 h，然后用水洗涤至中性，用2 mol/L NaOH浸泡4 h，再用水洗涤至中性，浸泡于2 mol/L HCl溶液中备用，临用前用水洗涤至中性即可。

大孔吸附树脂用无水乙醇浸泡24 h使其充分溶胀后取出，用无水乙醇洗去其中的添加剂，直至不产生白色浑浊为止，再浸泡于无水乙醇中备用，临用前用水洗涤至无醇味即可。

1.2.2 上样液的制备 将处理好的树脂徐徐加入层析柱中，同时打开活塞，使树脂在溶剂的流动作用下沉降并堆积成树脂床后，用水洗去原来的溶剂，然后将水放出直至液面与树脂床床面相平，关闭活塞。对于阳离子交换树脂，流出液应冲洗至中性，对于大孔吸附树脂，流出液无醇味即可。

干燥后的倒提壶药材进行粉碎，过筛得100目药材粉末。称取药材粉末60 g于500 mL圆底烧瓶中，加入360 mL 0.3%的HCl溶液，在90 ℃下回流提取1.5 h，过滤，收集滤液。重复3次，合并3次滤液，混合均匀即得提取液。将提取液在3 500 r/min下离心5 min，取上清液为上样液。上样液在低温下贮藏，备用。

1.2.3 样品的分离纯化 ①阳离子交换树脂洗脱：取处理好的001×732阳离子交换树脂20 mL进行湿法装柱，上样液放至室温，用2 mol/L HCl溶液调至pH 2.0后进行上样，上样量为100 mL，流速控制为2 mL/min，用100 mL 水洗去非离子性成分，再用520 mL的1 mol/L NaCl溶液以相同流速进行洗脱，收集洗脱液，备用。

样品检测：取5 mL NaCl洗脱液，用2 mol/L的NaOH溶液调至pH 10.0，挥干后加10 mL甲醇，超声处理后过滤，滤渣加10 mL甲醇，超声后过滤，合并滤液，挥干，甲醇定容至5 mL，进行HPLC分析。

②第一次大孔吸附树脂洗脱：取处理好的BS-65大孔吸附树脂80 mL进行湿法装柱，阳离子交换树脂的洗脱液用2 mol/L NaOH碱化至pH 10.0后以2 mL/min的流速进行上样，采用160 mL pH 9.0的碱水洗去水溶性杂质后，在相同流速下用100 mL的乙醚洗脱得到天芥菜碱，改用200 mL的50%乙醇水溶液洗脱即得毛果天芥菜碱。各自挥干，定容，进行HPLC分析。

③第二次大孔吸附树脂洗脱：取乙醚洗脱液水浴挥干，用50 mL水溶解，调至pH 10.0后，用100 mL pH 9.0的碱水洗去水溶性杂质，通过80 mL的大孔吸附树脂BS-65，用100 mL乙醚以2 mL/min的流速洗脱，收集洗脱液，得天芥菜碱溶液。挥干，定容，进行HPLC分析。

取50%乙醇水溶液洗脱液水浴挥干，用50 mL水溶解，调至pH 10.0后，以100 mL pH 9.0的碱水洗去水溶性杂质，通过80 mL的大孔吸附树脂BS-65，用200 mL 50%乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液，得毛果天芥菜碱溶液。挥干，定容，进行HPLC分析。

1.2.4 色谱分析条件 ①HPLC分析[16-17]：将上述处理液用0.45 μm滤膜过滤，按以下色谱条件测定：色谱柱Phenomenex Luna C18(5 μm，250 mm×4.6 mm)，流动相二元梯度洗脱：乙腈(A)，含0.1%三乙胺的水溶液(B)，流速：1.0 mL/min，检测波长：220 nm，柱温：室温，进样量：20 μL，梯度洗脱条件：0～10 min，15%～30%A；10～40 min，30%～50%A。

②TLC分析：取适量天芥菜碱和毛果天芥菜碱，溶于甲醇后，制成天芥菜碱和毛果天芥菜碱的混合标准溶液，混标液与待测样品按以下色谱条件分析：固定相：2%NaOH硅胶G薄层板；展开剂：氯仿-甲醇-浓氨水(4.5∶0.6∶0.3)；显色剂：碘化铋钾。

2 结果与讨论

2.1 大孔吸附树脂纯化条件的考察

2.1.1 大孔吸附树脂的选择 选择AB-8，BS-65，BS-30，HPD-400和CAD-40 5种树脂按照实验方法进行静态吸附和解吸附试验，考察了不同树脂对天芥菜碱和毛果天芥菜碱的吸附量、吸附率、解吸率和回收率。

精密称取上述树脂各约2.0 g，置于150 mL带塞锥形瓶中，精密加入浓度分别为1 042.8 μg/mL和1 006.0 μg/mL的天芥菜碱和毛果天芥菜碱原料药溶液100 mL，置于恒温振荡器中，在100 r/min，30 ℃条件下静态吸附3 h；过滤树脂，收集吸附后的溶液待测，然后用水洗吸附后树脂，滤干后置于150 mL干净的带塞锥形瓶中，精密加入100 mL 95%乙醇，置于恒温振荡器中，在100 r/min，30 ℃条件下静态解吸附3 h，过滤树脂，收集洗脱液待测。

表1 不同树脂对天芥菜碱及毛果天芥菜碱的吸附和解吸附情况

采用静态吸附实验，通过表1结果对比，发现BS-65大孔吸附树脂对天芥菜碱和毛果天芥菜碱的吸附量和回收率均明显优于其他型号的树脂。大孔吸附树脂可以有效地吸附具有不同化学性质的各种类型化合物，其吸附性能主要取决于吸附剂的表面性质,即树脂的极性(功能基)和空间结构(孔径、比表面积、孔容)，表1中只有AB-8和BS-65是非极性树脂，其在极性溶剂(加水)中吸附非极性物质,并且BS-65的比表面积比AB-8大，BS-65适合分离纯化生物碱成分，因此选择BS-65对天芥菜碱和毛果天芥菜碱进行分离。

2.1.2 pH值对树脂吸附量的影响 称取BS-65大孔吸附树脂0.5 g于100 mL带塞三角烧瓶中，分别加入pH 5.0，7.0，9.0，10.0，11.0的上样液25 mL，置于摇床中，在30 ℃，100 r/min下振荡12 h，取上清液，分别测定吸附前后溶液中天芥菜碱和毛果天芥菜碱的浓度，并计算其静态饱和吸附量。结果显示，两生物碱的吸附量均随pH值的升高而逐渐增大，这是因为随着pH值的增大，天芥菜碱和毛果天芥菜碱主要以分子形式存在于溶液中，增强了其与BS-65大孔吸附树脂的吸附作用力，有利于两种生物碱在BS-65树脂上的吸附。但当pH≥10时趋于平衡，吸附量基本不变化。因此，本实验在利用BS-65树脂对天芥菜碱和毛果天芥菜碱进行分离时，选择上样液的pH值为10.0。

2.1.3 洗脱剂的选择 考察了石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、丙酮、无水乙醇、50%乙醇水溶液7种洗脱剂的洗脱效果。结果显示，石油醚的洗脱液中无天芥菜碱或毛果天芥菜碱，可能是因为石油醚的极性过低，对天芥菜碱和毛果天芥菜碱的洗脱不利；丙酮、正丁醇和乙酸乙酯洗脱液中虽均含有天芥菜碱和毛果天芥菜碱，但分离效果不理想；在无水乙醇洗脱液和50%乙醇洗脱液中，均含有较高浓度的毛果天芥菜碱，但无水乙醇洗脱液中还含有较多杂质。乙醚洗脱液中也含有天芥菜碱和毛果天芥菜碱，但天芥菜碱的含量明显减少。从结构上看，天芥菜碱和毛果天芥菜碱均属于吡咯里西啶生物碱。天芥菜碱母核结构上含有两个羟基，毛果天芥菜碱母核结构上含有的两个羟基已形成酯基，故天芥菜碱的极性大于毛果天芥菜碱，50%的乙醇水溶液由于极性较大，故主要洗脱天芥菜碱，乙醚极性较小，主要洗脱毛果天芥菜碱。综合考虑，选择乙醚和50%乙醇水溶液分别对毛果天芥菜碱和天芥菜碱进行洗脱。

2.1.4 洗脱剂用量的考察 对洗脱剂用量进行TLC跟踪，用400 mL pH 9.0的碱水洗去杂质成分后以乙醚对毛果天芥菜碱进行洗脱，结合TLC检测结果显示，当毛果天芥菜碱洗脱完全后改用50%乙醇水溶液对天芥菜碱进行洗脱，直至TLC显示天芥菜碱洗脱完全。用HPLC对上述洗脱液进行分析，结果表明，分别使用100 mL乙醚和200 mL 50%乙醇水溶液进行洗脱可获得毛果天芥菜碱和天芥菜碱。

2.2 分离纯化效果的比较

对上样液通过以下4种不同的方式进行分离纯化：仅用BS-65大孔吸附树脂，仅用001×732阳离子交换树脂，001×732阳离子交换树脂与一次BS-65大孔吸附树脂联用，001×732阳离子交换树脂与两次BS-65大孔吸附树脂联用，结果见表2，洗脱液色谱图见图2。

表2 各种分离纯化天芥菜碱和毛果天芥菜碱方法的结果比较

由表2可知，毛果天芥菜碱与天芥菜碱的纯度分别由0.73%和2.2%提高至81.6%和79.2%；其纯度分别提高了111倍和36倍，提取率分别由4.6 mg/g和 10.7 mg/g提高至50.6 mg/g和92.7 mg/g。

对上样液(图2A)、通过阳离子交换树脂和一次大孔吸附树脂的乙醚洗脱液(图2B)、通过阳离子交换树脂和两次大孔吸附树脂的乙醚洗脱液(图2C)、通过阳离子交换树脂和一次大孔吸附树脂的50%乙醇水溶液洗脱液(图2D)以及通过阳离子交换树脂和两次大孔吸附树脂的50%乙醇水溶液洗脱液(图2E)进行HPLC色谱分析，结果见图2。

根据图2B和图2C可知，经过两次大孔吸附树脂之后，天芥菜碱基本被洗去，可分离出毛果天芥菜碱，由图2D和图2E可知，经过两次大孔吸附树脂之后，毛果天芥菜碱基本被洗去，可完全分离出天芥菜碱。由此可知，上样液经过001×732阳离子交换树脂与两次BS-65大孔吸附树脂联用进行分离纯化，使用乙醚和50%乙醇水溶液洗脱可将毛果天芥菜碱和天芥菜碱完全分离，提纯效果最佳。

3 结 论

本文采用阳离子交换树脂和大孔吸附树脂联用的方法，对倒提壶中的生物碱进行分离纯化，可以完全分离出天芥菜碱和毛果天芥菜碱。本方法具有成本低、污染小、周期短、操作简单、分离纯化效率高等特点，适合进行工业化生产。

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Research on Separation and Purification of Alkaloids inCynoglossum amabile Stapf et Drumm with Resin

FAN Qing-ya1*,ZHANG Hong-hui1，WANG Wan-hao2

(1.College of Pharmacy,Vocational and Technical College School of Xinyang,Xinyang 464000,China；2.Henan Pharmaceutical Tong-yuan Ltd.,Xinyang 464000,China)

A novel method was established to separate and purify alkaloids fromCynoglossumamabileStapfetDrummwith cation exchange resin(CER) coupled with macroporous adsorption resin(MAR) based on dynamic tests.The result indicated that the alkaloids extracted were eluted with water and NaCl through CER and twice with ether and 50%ethanol through MAR,then the purities of heliotrine and lasiocarpine were up to 81.6%and 79.2% from 0.73%and 2.2%,respectively.Extraction yields were up to 50.6 mg/g and 92.7 mg/g from 4.6 mg/g and 10.7 mg/g,respectively.The method has the advantages of low cost,low pollution,short cycle，high efficiency and simple operation,and is suitable for popularization in industry production.

cation exchange resin；macroporous adsorption resin；CynoglossumamabileStapfetDrummalkaloid；heliotrine；lasiocarpine；separation；purification

2016-03-23；

2016-04-13

信阳职业技术学院院级科研项目(14QN07)

实验技术

10.3969/j.issn.1004-4957.2016.10.021

O657.72；TQ460.72

A

1004-4957(2016)10-1338-05

*通讯作者：樊轻亚，硕士，讲师，研究方向：药物提取分离及分析,Tel：0376-6281969，E-mail：fqy2006hn@163.com