PKCα 抑制剂Calphostin C抑制TNF-α 诱导的骨髓间充质干细胞迁移

宋铁峰，王 楠，王会琴，袁 颖，黄丽文，庄春雨，张同存

（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

PKCα 抑制剂Calphostin C抑制TNF-α 诱导的骨髓间充质干细胞迁移

宋铁峰，王 楠，王会琴，袁 颖，黄丽文，庄春雨，张同存

（工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α ）可以诱导间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的迁移，但其促进迁移机制尚不清楚.研究使用Calphostin C抑制剂来抑制PKCα 的活性，从而研究TNF-α 诱导MSCs迁移的作用是否通过激活PKCα 来完成.利用50，ng/mL的TNF-α 处理MSCs，划痕实验和Transwell实验表明TNF-α 可以诱导MSCs的迁移.加入PKCα 的抑制剂Calphostin C后，可以抑制TNF-α 对MSCs迁移或侵袭的诱导，并降低迁移标志基因MYL9（Myosin light chain 9，MYL9）、CYR61（Cysteine rich 61，CYR61）的表达.以上结果表明，PKCα抑制剂Calphostin C可以抑制TNF-α 诱导的MSCs迁移.

MSCs；迁移；TNF-α；PKCα

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是一种具有多向分化能力的干细胞［1-3］.间充质干细胞不仅具有多向分化潜能，还能靶向迁移到损伤部位、慢性炎症部位及肿瘤部位，对于这些部位起到一定程度的修复作用［4］.对于间充质干细胞迁移机制的研究，有助于理解间充质干细胞“归巢”的分子机制，为自体修复和细胞治疗提供理论依据.间充质干细胞的体内归巢和体外迁移也像细胞的其他生理活动一样由不同因素诱导引发涉及不同的信号通路［5-7］.虽然多种诱导因子和信号通路被发现参与间充质干细胞的迁移过程，但是其具体的迁移机制依然不明确.

肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF），能引起肿瘤出现坏死，而对正常组织细胞无毒性，故称之为肿瘤坏死因子.肿瘤坏死因子有 3种亚型：TNF-α、TNF-β和 TNF-γ.TNF-α主要由单核细胞分泌，但在其他细胞中也有分泌，包括间充质干细胞［8-9］.作为炎症因子，TNF-α可以促进间充质干细胞的迁移，TNF-α 在MSCs迁移和黏附中均占有重要的作用.

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是1977年在鼠脑的胞质成分中发现的一种蛋白激酶，属于多功能丝氨酸和苏氨酸激酶，是 G蛋白偶联受体信号转导系统中的效应物.丝氨酸/苏氨酸激酶，PKC家族有3个亚家族：经典型 PKCS（α、β和 γ同种型）、新型PKCS（δ、θ、η、ε同种型）以及非典型PKCS（ζ和ι亚型）［10-11］.当被激活时，PKC磷酸化并转运到细胞膜，可调节信号转导途径［12］，参与多种细胞迁移和侵袭过程.有文献［13］报道，在肝癌细胞中 PKCα的表达诱导细胞的迁移和侵袭.有研究［14］显示，TNF-α 通过PKC信号通路诱导肺腺癌细胞迁移.

研究发现，TNF-α可促进MSCs迁移，但TNF-α影响MSCs迁移的机制目前仍不清楚.因此，在本研究中，首先用TNF-α诱导MSCs迁移，再采用PKCα的特异性抑制剂Calphostin C，进一步研究PKCα 在TNF-α 促进MSCs迁移这一过程中的作用.

1　材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物

健康SD（sprague dawley，SD）大鼠，由中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，实验动物许可证号为SCXK-（军）2012-0004，实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准.

1.1.2主要试剂

DMEM/LG培养基，Gibco公司；胎牛血清，浙江天杭生物科技有限公司；重组大鼠TNF-α，Peprotech公司；Calphostin C、MYL9抗体、CYR61抗体、β-actin抗体，Santa Cruz公司；DAPI、dNTP，北京索莱宝科技有限公司；IRDye®800，CW山羊抗鼠抗体、IRDye®680 山羊抗兔抗体，LI-COR公司；M-MLV逆转录酶、Trizol裂解液，上海英俊生物技术有限公司；随机引物 B0043，上海生工生物工程有限公司；Bestar®SybGreen qPCR Mastermix，DBI®Bioscience公司.

1.2方法

1.2.1骨髓间充质干细胞的提取及体外扩增培养

SD大鼠间充质干细胞的提取采用全骨髓贴壁法.选健康80～90，g的 SD大鼠，雄性，颈椎脱臼法处死.剪刀剪去皮毛，无菌条件下取股骨和胫骨，剔除骨表面肌肉.吸取含15%，胎牛血清的DMEM/LG放入已灭菌玻璃离心管中.剪开股骨、胫骨关节两端，用 5，mL一次性注射器吸取培养基冲洗骨髓腔.将带有骨髓悬浮物的培养液用移液器吹散后，转移到培养皿中，置于37，℃、5%， CO2培养箱中进行原代细胞培养.本研究所用的是第 3～7代的骨髓间充质干细胞.

1.2.2细胞加药处理

将MSCs以1×105，mL-1的密度接种于6孔板，分为4组：对照组，2%，血清DMEM/LG处理细胞；TNF-α 组，加 TNF-α（终质量浓度 50，ng/mL）于 2%，血清的 DMEM/LG中，处理细胞 24，h；Calphostin C组，用含Calphostin C（终浓度0.1，µmol/L）的2%，血清的DMEM/LG处理细胞24，h；Calphostin C+TNF-α组，先用含Calphostin C（终浓度0.1，µmol/L）的2%，血清的DMEM/LG处理细胞1，h，再加入终质量浓度为50，ng/mL的 TNF-α处理细胞 24，h.加药处理 24，h后，收集上述细胞进行后续实验.

1.2.3细胞划痕实验

将MSCs以1×105，mL-1的密度接种于6孔板，12～16，h后用 10，µL枪头在细胞间按“十”字型划出痕迹，同时加药处理，24，h后在倒置显微镜下进行观察拍照，观察细胞的弥合修复能力.

1.2.4Transwell实验

在 24孔板中加入 500，µL 10%，血清 DMEM/ LG（含所加的药 TNF-α），然后在小孔内放入小室，使小室下膜与培养基完全契合.在小室的上室中加入 5×104个细胞，放入培养箱培养.16，h后将Transwell的小室取出，用棉签轻轻擦去上室的细胞，PBS洗2次，每次5，min.4%，多聚甲醛室温固定下室细胞20，min，PBS洗2次，每次5，min.无水甲醇浸泡下室膜20，min，PBS洗2次，每次5，min.用DAPI染细胞核，室温放置 15，min，PBS洗 2次，每次5，min.共聚焦显微镜下照相.

1.2.5RNA的提取

用 0.5，mL Trizol裂解液在冰上裂解细胞15，min，重复吹悬使细胞充分裂解，加入0.1，mL的氯仿，剧烈振荡 15，s，静置 5，min，4，℃、12，000，r/min离心 10，min.取上层水相到另一 EP管中，加入等体积的异丙醇，混匀，-20，℃放置 30，min.12，000，r/min离心 10，min，弃掉上清液，加入 75%，乙醇 1，mL，洗涤RNA，离心弃掉上清液，室温晾干 RNA.加入 20，µL DEPC水溶解RNA，放于-80，℃保存.

1.2.6RNA逆转录及实时荧光定量 PCR（Real-time PCR）

将提取的RNA用M-MLV逆转录方法进行逆转录.RNA 2，µg、随机引物（B0043）5，µL，70，℃水浴5，min；迅速冰浴；10，mol/L dNTPs 5，µL、5×buffer 5，µL、RNAse inhibitor 0.625，µL、M-MLVRT 1，µL混匀，37，℃反应1，h；70，℃保持10，min终止反应.

用Bestar®SybGreen qPCR Mastermix进行Realtime PCR.扩增程序：95，℃ 2，min；95，℃ 10，s，60，℃30，s，72，℃ 30，s，40个循环.融解曲线：95，℃ 1，min，55，℃ 1，min，95，℃ 10，s.目的基因引物：GAPDH上游5′-ATTCAACGGCACAGTCAAGG-3′，GAPDH下游5′-GCAGAAGGGGCGGAGATGA-3′；CYR61上游5′-GAAGAAATACCGGCCCAAAT-3′，CYR61下游5′-CAGACTGTAGAGGCGAAACGAC-3′；MYL9上游5′-ATGAGGAGGTGGACGAGATGT-3′，MYL9下游5′-CGTGCTTGAGGATGCGAG-3′.

1.2.7免疫印迹实验（Western blot）

收集各组细胞，PBS洗1次，SDS细胞裂解液冰上裂解细胞，100，℃变性10，min，12%， SDS-PAGE电泳，电转法将蛋白转至 NC膜.5%，的脱脂奶粉室温封闭1，h后，分别用β-actin抗体（1∶500）、CYR61抗体（1∶500）、MYL9抗体（1∶500）4，℃孵育过夜，PBS洗3次，每次10，min；IRDye®800，CW 山羊抗鼠抗体（1∶5，000）、IRDye®680 山羊抗兔抗体（1∶5，000）室温孵育 2，h后，PBS洗 3次，每次 10，min，Odyssey成像系统进行扫膜成像.

1.2.8统计学分析

所有实验数据均用SPSS 13.0统计软件计算，实验数据均以“平均值±标准差”表示.用t检验显著性，*表示统计学上有显著性差异（P＜0.05）.

2　结果与分析

2.1划痕检测加入 Calphostin C后对 TNF-α 诱导MSCs迁移作用的影响

利用划痕实验检测细胞的迁移能力，结果如图 1所示.加入TNF-α 的MSCs细胞的愈合程度大于没有处理的MSCs细胞的愈合程度，证明 TNF-α 可以促进MSCs细胞的迁移.而加入Calphostin C+TNF-α 组的 MSCs细胞愈合程度小于加入 TNF-α 组的MSCs细胞愈合程度，证明 PKCα 的活性被抑制后，TNF-α 促进MSCs细胞的迁移作用也被抑制.

图1　Calphostin C抑制 TNF-α 诱导的 MSCs细胞迁移能力Fig.1　Calphostin C inhibits MSC migration induced by TNF-α

2.2Transwell检测加入Calphostin C后对TNF-α促侵袭作用的影响

利用 Transwell实验检测了细胞的侵袭能力，结果如图2所示.

图2　Calphostin C抑制TNF-α 诱导的MSCs细胞侵袭能力Fig.2　Calphostin C inhibits MSC invasion induced by TNF-α

加入TNF-α的MSCs细胞的侵袭能力大于没有处理的 MSCs细胞的侵袭能力，证明 TNF-α可以促进MSCs细胞的侵袭.而加入Calphostin C+TNF-α组的 MSCs细胞侵袭能力小于加入 TNF-α 组的MSCs细胞侵袭能力，证明 PKCα的活性被抑制后，TNF-α促进MSCs细胞的侵袭作用也被抑制.

2.3检测迁移marker的表达变化

细胞外基质蛋白 CYR61、细胞骨架蛋白 MYL9与细胞迁移有直接的关系［15-16］.利用 Real-time PCR的方法检测迁移maker MYL9、CYR61，mRNA水平的变化，结果如图3所示.TNF-α可以促进MYL9、CYR61，mRNA 表达的升高，而加入 Calphostin C抑制 PKCα 的活性后，TNF-α 的这种上调迁移 marker表达的能力被抑制.

图3　Calphostin C抑制 TNF-α 诱导的 MSCs细胞迁移maker mRNA表达水平Fig.3 Calphostin C inhibits the mRNA levels of migration markers induced by TNF-α in MSCs cells

利用Western blot检测这两种基因蛋白水平的变化，如图4所示.结果与mRNA水平的变化一致，进一步证明了TNF-α 促进MSCs细胞的迁移能力是通过激活PKCα.

图4　Calphostin C抑制 TNF-α诱导的 MSCs细胞迁移maker蛋白表达水平Fig.4 Calphostin C inhibits the protein expression of migration markers induced by TNF-α in MSCs cells

3　讨 论

肿瘤坏死因子 TNF-α 分泌前体是跨膜蛋白，然后经过 TNF-α 转化酶的剪切修饰转变为可溶性状态.每一种可溶性的亚型均有生理活性，TNF-α 的主要生理作用都是通过TNFR1，将信号传达到细胞内，启动一系列的生理反应.作为炎症因子，TNF-α 促进间充质干细胞的迁移已有相关研究.有研究［5］显示，TNF-α 可以增强间充质干细胞的迁移能力，增加ERK的磷酸化和p38蛋白的磷酸化；加入 p38的抑制剂 SB203580后，细胞间黏附分子 1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）表达升高，抑制了TNF-α 引起的间充质干细胞的迁移.在 Ponte等［17］的研究中，发现 TNF-α 可以大大增强趋化因子RANTES（regulated upon activation normal T cell expressed and secreted facyor，RANTES）和SDF-1（stromal-cell derived factor-1，SDF-1）诱导 MSCs迁移的能力.PKCα 是信号传导PKC的大家族成员之一，在肝癌细胞中，PKCα 激活AKT/MAPK信号通路，诱导细胞的增殖、迁移和侵袭［13］.研究［14］显示，在人的肺腺癌细胞中，TNF-α 诱导的 CLDN1（claudin-1，CLDN1）表达及细胞迁移通过 PKC信号通路.同时有文献报道，MSCs的迁移与PKC信号通路相关，Lin等［18］发现白细胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）通过 PKC信号通路激活肌球蛋白轻链激酶（myosin light chain kinase，MLCK），从而诱导MSCs迁移.Tang等［19］发现乙酰胆碱通过PKC信号通路诱导MSCs迁移.

本文发现TNF-α 可以促进MSCs细胞迁移和侵袭，并且通过加入PKCα 特异性抑制剂Calphostin C证实 TNF-α 诱导 MSCs细胞迁移通过 PKCα 通路.接下来可以通过RNA干扰技术敲低PKCα ，进一步验证结论作出补充.虽然多种诱导因子和信号通路被发现参与间充质干细胞的迁移过程，但是其具体的迁移机制依然不明确.在 TNF-α 诱导的MSCs迁移过程中是否还存在其他分子参与其中，激活PKCα 从而促进TNF-α 诱导MSCs迁移是不是唯一的途径，这些问题还有待于进一步研究.

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责任编辑：郎婧

Inhibiting the Migration of Mesenchymal Stem Cells Induced by TNF-α with PKCα Inhibitor Calphostin C

SONG Tiefeng，WANG Nan，WANG Huiqin，YUAN Ying，HUANG Liwen，ZHUANG Chunyu，ZHANG Tongcun
（Key Laboratory of Industrial Fermentation Microbiology，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Industrial Microbiology，College of Biotechnology，Tianjin University of Science & Technology，Tianjin 300457，China）

Inflammatory cytokine TNF-α can induce the migration of MSCs，but the mechanism of migration remains unclear.This study used PKCα inhibitor Calphostin C to inhibit PKCα activity，in order to know whether the migration of MSCs induced by TNF-α was accomplished by activating PKCα.MSCs were treated with 50，ng/mL of TNF-α.Wound heal assay and Transwell assay confirmed that TNF-α could induce the migration of MSCs.PKCα inhibitor Calphostin C inhibited TNF-α-induced MSC migration or invasion and reduced the expression of migration marker genes MYL9，and CYR61.In conclusion，PKCα inhibitor Calphostin C can inhibit the migration of MSCs induced by TNF-α.

MSCs；migration ability；TNF-α；PKCα

Q28

A

1672-6510（2016）04-0015-05

10.13364/j.issn.1672-6510.20150148

2015-10-08；

2015-12-08

国家自然科学基金资助项目（31171303）

宋铁峰（1990—），女，黑龙江人，硕士研究生；通信作者：张同存，教授，tony@tust.edu.cn.