基因芯片快速检测分枝杆菌技术辅助诊断小儿结核病的临床研究

熊丽君+阮琰+严红梅+唐伟伟+陈晓红+林剑东+黄明翔

[摘要] 目的 探讨基因芯片快速检测分枝杆菌技术在辅助诊断小儿结核病方面的临床研究。方法 方便选取2014年7月—2015年7月住于该院的经临床、放射线疑诊0～14岁肺结核77例为观察对象，采用晶芯@结核病分子诊断系统对观察对象痰标本进行检测，将检测结果与最终诊断相比较，并与罗氏痰培养结核菌法、痰涂片找结核菌、DNA检测、PPD试验、结核抗体、对INH＼RFP耐药性及对非结核分枝杆菌菌种鉴定结果进行对比，分别计算各检测方法的灵敏度和特异度，从而判断基因芯片技术在诊断儿童结核病可行性、敏感、快速。结果 重症结核感染17例，其中有9例（11.69%）为血行播散型肺结核，7例（9.09%）合并有结核性脑膜炎，1例（1.3%）合并骨结核。检测异烟肼耐药相关基因，基因芯片法和罗氏培养法比较χ2 =2.286，P=0.515，Kappa=0.604，检测利福平耐药相关基因，基因芯片法和罗氏培养法比较χ2 =58.77，P<0.05，Kappa=0.587。基因芯片法与罗氏培养法、PPD试验、结核DNA、结核抗体、痰涂片多重比较，χ2 =64.91，P<0.05。 结果 基因芯片法可以快速检测结核分枝杆菌，与罗氏培养法检测结核分枝杆菌拥有中等一致性，其快速、无创，可以用于辅助诊断小儿结核病。

[关键词] 小儿；结核病；基因芯片法

[中图分类号] R5 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2016）10（b）-0050-04

[Abstract] Objective To investigate the clinical study of rapid detection of Mycobacterium tuberculosis by gene chip in the diagnosis of pediatric tuberculosis. Methods Convenient selection clinical， X-ray suspected 0-14 years old pulmonary tuberculosis 70 cases in July 2014 to July 2015 live in our hospital as the observation object by Jingxin @ TB molecular diagnostic system of the observed object sputum specimens were detected， test results and final diagnosis was compared， in parallel with Roche sputum Mycobacterium tuberculosis， sputum smear， culture on the find tuberculosis bacteria， DNA testing， the PPD test， tuberculosis antibody， on drug resistance of INH＼RFP and of non tuberculosis mycobacterium species identification results were compared were calculated sensitivity and specificity of the detection method， in order to determine the gene chip technique in the diagnosis of childhood tuberculosis feasibility， sensitive， rapid. Results 17 cases of severe tuberculosis infection， including 9 cases （11.69%） were blood disseminated pulmonary tuberculosis， 7 cases （9.09%） with tuberculous meningitis， 1 cases （1.3%） with bone tuberculosis. Detection of isoniazid resistant related genes and gene chip method and Roche culture method χ2=2.286， P = 0.515， Kappa = 0.604， detection of rifampin resistance related gene， gene chip method and Roche culture method χ2=58.77， P < 0.05， Kappa =0.587. Gene chip and Roche culture method， PPD test， tuberculosis DNA， tuberculosis antibody， sputum smear multiple comparison. χ2=64.91， P < 0.05. Conclusion The gene chip method can quickly detect Mycobacterium tuberculosis， and the Roche culture method for detection of Mycobacterium tuberculosis with moderate consistency， its rapid， noninvasive， can be used for the diagnosis of tuberculosis in children.

[Key words] Children； Tuberculosis； Gene chip method

据2014年8月国家结核病预防控制中心与国际防痨与肺部疾病联合会召开的会议，WHO人员预计我国儿童结核病的患者例数应占总人口患者例数的6%[1]。多个地区的调查结果也显示儿童耐药结核病发病率有所升高。然而由于儿童结核病痰涂片率及阳性率低，这些都给儿童结核病的诊断带来更大困难。儿童结核病的漏诊和误诊较高，在临床工作中，高灵敏度、高特异性、耗时短的检测技术能带来更大的便利。众所周知，各种结核杆菌的耐药均由于基因突变或基因转化，该研究采用晶芯@结核病分子诊断系统完成于2014年7月—2015年7月住于该院77例疑似结核病儿童的痰标本进行检测，其结果与最终诊断相比较，并与PPD试验、结核DNA、痰涂片、痰培养结核菌检测结果进行对比，分别计算各检测方法在诊断结核病及判断异烟肼和利福平耐药情况的灵敏度和特异度，同时计算出检测非结核分枝杆菌的灵敏度和漏诊率，从而判断基因芯片技术在诊断儿童结核病是否有更可靠、敏感、快速的意义，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

方便选取入住于福州肺科医院疑似肺结核儿童77例，年龄0～14岁，其中男童41例，女童36例，该研究经福州肺科医院伦理委员会同意，所有入组患儿均取得患儿家属知情同意。

1.2 疑似临床结核病判断指标

临床上均有咳嗽、发热2周以上，同时具有下列一项：①结核中毒症状或结核病接触史；②胸片显示肺结核征象；③结核菌纯蛋白衍生物（PPD）试验48～72 h直径≥10 mm。排除近期抗结核治疗超过1个月者。

1.3 标本采集

入院后24 h内完成对标本采集，对3岁以下无法自行吐痰者，均于晨起空腹拍背10 min后，吸引器接痰杯负压吸引法留取痰标本5 mL，3岁及3岁以上儿童鼓励患儿漱口后自行咳痰5 mL，分别检测痰涂片找结核菌、痰结核DNA、痰培养结核菌（罗氏培养法）、基因芯片技术检测。所有患儿入院24 h内均行PPD试验，72 h判读结果。其余与诊断相关的检查如生化、胸片、肺部CT等按照诊断标准所需进行检查。

1.4 基因芯片技术检测

该院检验科对收集的痰标本24 h内进行基因芯片技术检测，过程包括：样品制备、芯片反应与洗干、结果判读，整个过程不超过24 h，所有操作流程均严格按照仪器使用说明书进行。所有仪器均由博奥生物有限公司生产。

1.4.1 样品制备 3 h内可以鉴定结核与非结核分枝杆菌，6 h鉴定非结核分枝杆菌类型，及判断异烟肼及利福平的耐药情况。将消化液（10 mL 4%碳酸氢钠、10 mL 2.94%柠檬酸三钠、0.1 g N-乙酰-L-半胱氨酸）预处理好的痰标本放入晶芯ExtractorTM核酸快速提取仪中提取核酸，再将提取的核酸加入基因扩增仪中进行扩增，并在4℃保存。

1.4.2 芯片反应与洗干 基因扩增产物经变性后加入到结核分枝杆菌耐药检测试剂盒的芯片点阵中，然后放入晶芯Biomixer芯片杂交仪进行芯片反应。再将完成杂交的芯片放入晶芯Slide WasherTM芯片洗干仪中进行洗干。

1.4.3 结果判读 将洗干的芯片载入晶芯LuxScan10K-B微阵列芯片扫描仪中，自动进行结果判读。

1.5 统计方法

用SPSS 18.0统计学软件进行数据分析，利用传统罗氏培养菌和药敏试验的检测结果作为金标准对基因芯片技术的检测结果进行比对，计算基因芯片法的灵敏度、特异度和符合率，用χ2 检验和Kappa检验分析药敏实验与基因芯片结果的一致性；另外计算痰涂片找结核菌、PPD试验、血结核抗体、痰结核DNA的阳性率，与基因芯片法的阳性率应用χ2 检验相比较，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患儿临床资料

该研究共收集77例最终诊断肺结核患儿，其中1例为非结核分枝杆菌感染，其余76例均考虑为结核分枝杆菌感染。77例患儿平均年龄7.86岁，最小的和最大的分别为2月和14岁，其中男童平均年龄（7.09±5.01）岁，女童（8.73±5.05）岁，均为初治患儿。

2.2 基因芯片法与罗氏培养法分别检测异烟肼和利福平耐药基因及药敏结果比较

两种方法检测KatG、inhA以及rpoB突变的耐药和药敏情况，见表1、表2。

2.3 基因芯片法与痰涂片找结核菌、PPD试验、血结核抗体、痰结核DNA检测结果比较

3 结语

该研究中，重症结核感染17例，其中有9例（11.69%）为血行播散型肺结核，7例（9.09%）合并有结核性脑膜炎，1例（1.3%）合并骨结核，早期诊断儿童结核感染，以避免发展为重症结核甚至危及生命显得至关重要。传统的罗氏培养法一直是临床诊断结核感染的金标准，但其耗时长，对标本及操作人员技术要求严格，在临床应用上具有一定的局限性。目前临床医师多数综合患儿临床特征、PPD结果、结核病接触史、结核DNA、结核抗体、影像学表现及痰涂片结核菌等来诊断儿童结核病，多数为临床诊断，因标本取材困难，难以做到实验室确诊，若疑似结核感染患儿要等待痰培养结核菌结果再确诊后治疗，可能会引起结核播散、发展为重症结核乃至危及生命。而检测基因芯片法用于结核病的辅助诊断，利用灵敏度高、特异性高、简便、快速的优势，可在临床基础医疗机构推广[2]。因基因芯片检测对实验室要求较高，县级结防机构也可运送标本至地市级医院检测，标本转运更适合于人口稠密的中东部地区[3]。

该研究中，基因芯片法灵敏度为48.05%，漏诊率51.95%，灵敏度高于罗氏培养法45.45%，漏诊率低于罗氏培养法54.55%，而痰涂片找结核菌的漏诊率最高79.22%，PPD的灵敏度较高59.74%，漏诊率较低51.95%，分析基因芯片法检测结核菌的灵敏度较成人报道[4]低，可能与儿童取标本困难有关。将基因芯片法与罗氏培养法、PPD试验、结核DNA、结核抗体、痰涂片多重比较，χ2=64.91，P<0.05，说明6种检测方法差异有统计学意义，在临床工作中应采用多种方法联合检验，以综合各自不足互补。对于异烟肼的耐药性基因芯片检测技术与罗氏培养结核菌的符合率为0.604，而利福平耐药性两种方法的Kappa=0.587，均为中等一致性，与国内部分学者研究结果相似。近些年，随着基因芯片技术的推广，其用于检测结核菌及判断异烟肼和利福平耐药性的相关文献也越来越多。李卫彬等[5]用基因芯片技术对初治涂阳患者异烟肼耐药的检测效果与金标准差异统计学意义，灵敏度为92.59%，Kappa值为0.51，阳性预测值为46.51%；检测复治涂阳患者异烟肼耐药的灵敏度为92.59%，Kappa值为0.76，阳性预测值为78.13%；检测初治涂阳患者利福平耐药的敏感度为90.48%，Kappa值为0.82，阳性预测值为76%；检测复治涂阳患者利福平耐药的灵敏度为91.18%，Kappa值为0.82，阳性预测值为88，57%。欧维正等[6]对比基因芯片法和比例法药物敏感试验检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性，基因芯片法和比例法药物敏感试验检测MTB对RFP耐药性的符合率93.27%，对INR耐药性的符合率95.11%，且基因芯片法较比例法药物敏感试验具有更高的敏感性和特异性。值得注意的是，对于检测标本是否存在异烟肼耐药，基因芯片法和罗氏培养法P>0.05，说明两种方法差异无统计学意义；而对于检测利福平耐药方面，基因芯片法和罗氏培养法卡方检验P<0.05，说明两种方法在检测利福平耐药方面差异有统计学意义。

国外关于应用基因芯片技术检测异烟肼和利福平耐药性的研究也较多，台湾Shu-Ting Tseng等[7]分析70例异烟肼耐药结核分枝杆菌，有15例katG基因突变，2例inhA基因突变。墨西哥E. Yu. Nosova等[8]对比分析基因芯片、Xpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus 3种方法快速检测痰标本结核菌DNA及耐药情况，3者的检出率分别是78%、92%、49%，得出结论XpertMTB/RIF方法检测结核DNA是最有效的，但是基因芯片法是唯一一种既能快速检测出结核菌DNA，也可判断多重耐药结核菌感染的方法。

总之，基因芯片法拥有快速检出结核分枝杆菌感染，并判断异烟肼和利福平耐药性，并可检出非结核分枝杆菌，但它也有局限性，如检测儿童结核分枝杆菌感染的灵敏度并不高。在儿童标本采集及检测方面都有待进一步提高。相信随着结核病诊断技术的不断提高，进一步加强地方结核病防治所的结核病规范化治疗，儿童结核病能得到早发现、早诊断、早治疗，势必能减少未来重症结核病和耐多药结核的发生。

[参考文献]

[1] 中国结核病预防控制中心结核病预防控制中心，国家防痨与肺部疾病联合会，儿童结核防治研讨会会议材料[Z].北京：中国疾病预防控制中心结核病预防控制中心，2014.

[2] 李艳英.基层常用结核病诊断方法及展望[J].临床肺科杂志，2012，17（11）：2103-2104.

[3] 刘保华，逢宇，张治英，等.县级运送痰标本至地市开展基因芯片耐药检测的成本分析[J].中国防痨杂志，2015，37（6）：611-615.

[4] 梁桂亮，李晓非，欧阳兵，等.基因芯片检测技术在结核病诊断中的运用[J].临床肺科杂志，2015，20（7）：1234-1237.

[5] 李卫彬，李新旭，张彤群，等.基因芯片检测技术检测结核分枝杆菌异烟肼和利福平耐药的实际应用效果评价[J].中华临床医师杂志：电子版，2012，6（16）：4666-4670.

[6] 欧维正，骆科文，王燕，等.基因芯片和比例法药物敏感试验检测结核分枝杆菌对异烟肼和利福平耐药性的比较研究[J].检验医学，2013，28（5）：404-407.

[7] Shu -Ting Tsenga，Chun-Hsi Taia，et al.The mutations of katG and inhA genes of isoniazid-resistant Mycobacterium tuberculosis isolates in Taiwan[J].Journal of Microbiology， Immunology and Infection，2015，48（3）：249-255.

[8] E. Yu. Nosova，M.A.Krasnova，et al. Comparative analysis of TB-Biochip， Xpert MTB/RIF， and GenoType MTBDRplus test systems for rapid determination of mutations responsible for drug resistance of M. tuberculosis complex （in sputum from patients in Moscow region）[J].Molekulyarnaya Biologiya， 2013， 47（2）： 267-274.

（收稿日期：2016-07-16）