当归挥发油对高血压模型大鼠血压及血管炎症反应的影响

刘倍吟 魏程科 李应东

摘要：目的 观察当归挥发油对高血压模型大鼠血压和相关炎症因子的影响，探讨其降压的作用机制。方法 采用N-硝基-L-精氨酸灌胃建立高血压大鼠模型。实验大鼠随机分为正常组、模型组、阳性药组和当归挥发油高、低剂量组，每组5只。各给药组给予相应药物灌胃，连续8周。采用无创血压检测系统检测给药前后大鼠尾动脉收缩压；ELISA检测大鼠血清内皮素-1（ET-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、超敏C反应蛋白（CRP）水平；实时荧光定量PCR检测心脏组织CRP mRNA表达。结果 与正常组比较，模型组收缩压、ET-1、VCAM-1、CRP水平及其mRNA表达明显升高（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，各给药组ET-1、VCAM-1、CRP水平及其mRNA表达明显降低（P<0.05，P<0.01）。结论 当归挥发油可能通过抑制血管炎症反应起到降压作用。

关键词：当归挥发油；高血压；炎症细胞因子；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.017

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0071-04

Abstract： Objective To observe the effects of volatile oil of Angelicae Sinensis Radix on blood pressure and related inflammatory cytokines of hypertensive rat models； To investigate the action mechanism of regulating the blood pressure. Methods Wistar male rats were fed with L-NNA to establish hypertensive rat models. Hypertensive rats were randomly divided into normal control group， model group， positive medicine group， volatile oil of Angelicae Sinensis Radix high- and low-dose groups， with 5 rats in each group. Each medication group was given relative medicine for gavage for 8 weeks. Non-invasive blood pressure measurement system was used to observe the systolic pressure of tail artery of rats before and after medication； the levels of ET-1， CRP， and VCAM-1 in serum were detected by the method of ELISA； RT-PCR was used to measure CRP mRNA of heart. Results The levels of systolic blood pressure， ET-1， VCAM-1， CRP and CRP mRNA in model group were significantly higher than those of normal group （P<0.05， P<0.01）； Compared with model group， the levels of ET-1， VCAM-1， CRP and CRP mRNA in model group significantly decreased （P<0.05， P<0.01）. Conclusion Volatile oil of Angelicae Sinensis Radix can inhibit vascular inflammatory response and then realize the effects of regulating blood pressure.

Key words： volatile oil of Angelicae Sinensis Radix； hypertension； inflammatory cytokines； rats

血管内皮功能障碍是高血压的重要病理机制，其与血管炎症反应密切相关[1]。已有研究表明，当归具有减轻炎症反应、抗氧化、抗血小板凝集、延缓衰老、增强免疫力等药理作用[2]。当归挥发油是当归的脂溶性成分，主要含有藁本内酯、丁烯基苯酞等，可降低兔胸主动脉平滑肌的张力、扩张血管[3]，减轻炎症反应[4]，而对高血压发病过程中血管内皮功能及血管炎症反应的作用，目前尚未见相关报道。据此，我们采用N-硝基-L-精氨酸（L-NNA）灌胃建立高血压大鼠模型，观察当归挥发油对大鼠血清内皮素-1（ET-1）、血管细胞黏附分子-1（VCAM-1）、超敏C反应蛋白（CRP）水平及其mRNA表达的影响，揭示其对血压和炎症因子的干预作用，探讨其降压的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

雄性13周龄Wistar大鼠30只，体质量（240±20）g，SPF级，甘肃中医药大学动物实验中心，许可证号SCXK（甘）2011-0001。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，室温（23±2）℃、湿度45%～55%，自由饮水进食。

1.2 药物

当归挥发油（含藁本内酯>75%），甘肃岷县康达药业开发有限责任公司，超临界CO2萃取，1%吐温-80助溶，加蒸馏水配成所需浓度；卡托普利片，上海旭东海普药业有限公司，批号141005；L-NNA，上海源叶生物有限公司，批号YY10014-100g。

1.3 主要试剂与仪器

ET-1、CRP、VCAM-1 ELISA试剂盒，上海源叶生物科技有限公司；Trizol RNA提取试剂，Invitrogen公司；Reverse Transcription System、qPCR Master Mix试剂盒，Promega公司；TMC203型BP-98A动物无创血压测定系统，日本东芝公司；多功能酶标仪，瑞士Tecan Infinite；超微量紫外可见分光光度计，美国Quawell；Sorvall Fresco低温高速离心机，美国索福公司；实时荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司；JY600电泳仪，北京君意东方电子设备有限公司；Gel Doc XR+凝胶成像系统，美国BIO-RAD公司。

2 实验方法

2.1 造模

30只雄性Wistar大鼠适应性饲养7 d，于第6日14：00测定收缩压，每只大鼠测量3次，取平均值。随机取5只大鼠作为正常对照组，其余25只大鼠第7日10：00每日灌胃L-NNA 490 mg/kg，连续28 d，于第7、14、21、28日14：00测量收缩压，每只大鼠测量3次，取平均值，以平均收缩压≥180 mm Hg为造模成功标准。停药后正常饲养5 d，14：00测定收缩压，每只大鼠测量3次，取其平均值，结果20只大鼠造模成功。

2.2 分组及给药

造模前随机选取5只Wistar大鼠作为正常组；造模后将成模大鼠按体质量、收缩压分为模型组、阳性药组、当归挥发油高剂量组（中药高剂量组）、当归挥发油低剂量组（中药低剂量组），每组5只。阳性药组每日予卡托普利药液25 mg/kg灌胃，相当于临床成人日用量的10倍；中药高剂量组每日予含当归挥发油10%当归挥发油乳剂15 mL/kg灌胃，相当于成人日用当归原药材30 g的20倍；中药低剂量组每日予含当归挥发油5%当归挥发油乳剂15 mL/kg灌胃，相当于成人日用当归原药材30 g的10倍；模型组和正常组予等容量生理盐水灌胃。每日1次，连续8周。

2.3 大鼠血压观察

用BP-98A动物无创血压测量系统测定安静状态下大鼠尾动脉收缩压，于给药第0、5、15、25、35、45、55、60日14：00测量血压，每只大鼠测量3次，取其平均值。

2.4 标本采集

第61日乙醚麻醉大鼠，腹主动脉取血10 mL，静置30 min，4000 r/min离心10 min，分离血清；取心脏组织，液氮冷冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。

2.5 ELISA检测血清内皮素-1、血管细胞黏附分子-1、超敏C反应蛋白水平

按试剂盒说明设置标准品孔和样本孔，每组3个复孔，标准品稀释成5个梯度（浓度为0的标准品S0号视为空白孔），每孔50 μL；样本孔先加待测样本10 μL，后加样本稀释液40 μL；除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶标记的检测抗体100 μL，封板膜封住反应孔，37 ℃水浴60 min；弃液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1 min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次；每孔加入底物A、B各50 μL，37 ℃避光孵育15 min；每孔加入终止液50 μL，15 min内，于450 nm波长处测定各孔OD值。以标准品浓度为横坐标，对应OD值为纵坐标，绘制标准曲线，按曲线方程计算各样本浓度值，各样本浓度×5即为样本实际浓度。

2.6 RT-PCR检测心脏组织超敏C反应蛋白基因表达

2.6.1 提取总RNA 称取心脏组织1.8 g，置于4 mL无酶EP管内，各加1.5 mL预冷PBS，用组织匀浆器匀浆；4 ℃、3000 r/min离心10 min，弃上清液；各加1 mL Trizol，混匀；转移到1.5 mL无菌管中，冰上静置5 min；各加0.2 mL氯仿，剧烈振荡15 s，冰上静置2 min，4 ℃、13 500 r/min离心15 min，取上清液至新的离心管中；各加入等体积异丙醇，轻轻混匀，冰上静置10 min，4 ℃、13 500 r/min 离心10 min，弃上清液；向沉淀中缓慢轻轻加入-20 ℃预冷的75%乙醇1 mL，小心清洗沉淀；4 ℃、13 500 r/min离心10 min；弃上清液，室温干燥5 min，各加40 μL 1‰DEPC水溶解沉淀；紫外分光光度法测定总RNA，用1‰DEPC水调整总RNA至相同浓度500 ng/μL。

2.6.2 cDNA反转录 冰上配制10 μL反转录反应体系[2 μL MgCl2，2 μL 5×Reaction Buffer，1 μL PCR Nucleotide Mix，0.25 μL Oligo（dT）15 Primer，0.5 μL Go Script Reverse Transcriptase，0.25 μL Ribonuclease Inhibitor，3 μL RNase Free Water，1 μL总RNA样本]，反应条件：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃、60 min；CRP反应引物、GAPDH内参基因由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，见表1。

2.6.3 RT-PCR扩增 冰上配制20 μL PCR反应体系[12.5 μL qPCR Master Mix，0.25 μL CxR Reference Dye，4.25 μL Nuclease-Free Water，2 μL引物，1 μL模板DNA]，反应条件：94 ℃、2 min，94 ℃、30 s，58 ℃、30 s，72 ℃、1 min，72 ℃、5 min，35个循环，4 ℃保存。反应及数据采集在CFX-96系统上进行，记录CRP与内参基因GAPDH达到荧光设定值所需循环数（Ct值），每个样品中CRP的相对mRNA表达采用2-ΔΔCt法计算。

2.6.4 琼脂糖凝胶电泳 1.5%琼脂糖凝胶电泳，用Bio-Rad Gel Doc XR+凝胶成像系统分析，确认目的片段是否表达。

3 统计学方法

采用SPSS18.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 当归挥发油对模型大鼠血压的影响

与正常组比较，模型组大鼠收缩压明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组相关时点收缩压明显下降，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

4.2 当归挥发油对模型大鼠血清内皮素-1、血管细胞黏附分子-1及超敏C反应水平的影响

与正常组比较，模型组大鼠血清ET-1、VCAM-1及CRP水平明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，各给药组大鼠血清ET-1、VCAM-1及CRP水平明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。结果见表3。

4.3 当归挥发油对模型大鼠心脏组织超敏C反应蛋白基因表达的影响

与正常组比较，模型组大鼠心脏组织CRP mRNA表达明显升高，差异有统计学意义（P<0.01）；与模型组比较，各给药组CRP mRNA表达明显降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结果见表4、图1。

5 讨论

高血压是慢性血管炎症反应性疾病，血管功能障碍是高血压的重要病理特征。研究表明，在高血压发展过程中，循环系统促炎症细胞因子增多，血管炎症反应与血管功能障碍密切相关[5]。本实验结果表明，给予L-NNA后，抑制一氧化氮（NO）合成，使血管内皮收缩，增加血管张力，血压升高，持续性引起NO合成减少，则会导致血压持续升高。因此，本实验选择L-NNA建立高血压模型。

CRP触发炎症反应，可以诱导大鼠血管平滑肌细胞分泌肿瘤坏死因子-α，并且受P38MAPK-Toll样受体4（TLR4）信号通路调控。炎症因子产生增多，可以破坏内皮功能，引起收缩性因子分泌增多，同时血管内皮功能紊乱后又可活化巨噬细胞表面TLR4，进一步激活核因子-κB使炎症因子增多。因此，高血压血管内皮损伤与炎症反应相互影响。通过干预炎症反应，可以减轻炎性因子对高血压患者带来的负效应。

VCAM-1属于免疫球蛋白超家族，在炎症反应、肿瘤发展及免疫损伤时，VCAM-1表达增多，介导炎症反应[6]。

综上所述，本实验探讨当归挥发油对高血压模型大鼠血压的影响，结果显示当归挥发油可以降低血压，降低模型大鼠血清ET-1、CRP、VCAM-1的表达，RT-PCR结果显示，CRP mRNA表达给药后下调，进一步明确当归挥发油可以降低高血压炎症因子的表达，抑制血管炎症反应，这可能是其降压的潜在机制，其具体机制还有待进一步研究。

参考文献：

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[2] 马瑞君，王钦，陈学林，等.当归的研究进展[J].中草药，2002，33（3）：280-282.

[3] 吴国泰，高云娟，田振华，等.当归挥发油对兔离体胸主动脉平滑肌的影响[J].甘肃中医学院学报，2011，28（5）：1-3.

[4] 刘琳娜，程建峰.乙醇提取新鲜当归挥发油的抗炎镇痛作用[J].中国药房，2002，13（9）：526-527.

[5] BOMFIM G F， ECHEM C， MARTINS C B， et al. Toll-like receptor 4 inhibition reduces vascular inflammation in spontaneously hypertensive rats[J]. Life Sciences，2015，122：1-7.

[6] 陈静.清眩颗粒对高血压患者炎症反应及其诱导内皮损伤的干预效应研究[D].北京：中国中医科学院，2009.