香砂六君子汤对脾胃虚弱型萎缩性胃炎大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素—6、10及热休克蛋白70表达的影响

王强 王庆胜 鲁鹏程 成映霞 李兰珍 段云燕 段永强 杜娟 刘雪松

摘要：目的 观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型慢性萎缩性胃炎（CAG）大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素（IL）-6、IL-10及热休克蛋白70（HSP70）基因及蛋白表达的影响，探讨其作用机制。方法 受试大鼠按随机数字表法分为空白组和造模组，采用综合法复制脾胃虚弱型CAG动物模型，将成模大鼠随机分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组。空白组和模型组大鼠予10 mL/（kg·d）蒸馏水灌胃，香砂六君子汤高、中、低剂量组分别予24、12、6 g/（kg·d）香砂六君子汤药剂灌胃，阳性对照组予0.30 g/（kg·d）维霉素药剂灌胃，连续120 d。检测各组大鼠胃窦黏膜组织IL-6、IL-10含量，实时荧光定量PCR检测胃窦黏膜组织IL-6、IL-10和HSP70 mRNA表达，蛋白免疫印迹法检测HSP70蛋白表达。结果 与空白组比较，模型组大鼠一般生存状况较差，大鼠胃窦黏膜组织IL-6 mRNA表达、IL-6含量显著升高（P<0.05，P<0.01），IL-10 mRNA表达、IL-10含量显著降低（P<0.05，P<0.01），HSP70基因和蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，香砂六君子汤高剂量组大鼠一般生存状况明显改善，大鼠胃窦黏膜组织IL-6 mRNA表达、IL-6含量显著降低（P<0.05，P<0.01），IL-10 mRNA表达、IL-10含量显著升高（P<0.05），香砂六君子汤高、中剂量组HSP70基因和蛋白表达显著升高（P<0.05）。结论 香砂六君子汤对脾胃虚弱型CAG大鼠胃窦黏模具有保护作用。

关键词：香砂六君子汤；萎缩性胃炎；白细胞介素-6；白细胞介素-10；热休克蛋白70；大鼠

DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2016.11.015

中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2016）11-0062-05

Abstract： Objective To observe the effects of Xiangsha Liujunzi Decoction （XSLJZ） on levels and mRNA of IL-6， IL-10 and protein expression of HSP70 of gastric mucosa in chronic atrophic gastritis （CAG） rats with spleen-stomach deficiency； To discuss its mechanism. Methods Rats were divided into 2 groups through random number table： normal group and model group. The model of CAG rat with spleen-stomach deficiency type was induced by synthetic methods. After successful modeling， rats were divided into model group， positive control group， XSLJZ high-， medium-， low-dose group. Rats in normal and model group received distilled water 10 mL/（kg·d） for gavage； XSLJZ high-， medium-， low-dose group received XSLJZ 24， 12， 6 g/（kg·d）， respectively； positive control group received mycin 0.30 g/（kg·d） for gavage for 120 consecutive days. Generally living conditions， levels and mRNA of IL-6， IL-10 and protein expression of HSP70 in gastric mucosa tissue were detected by protein immunoblotting. Results Compared with the normal group， generally living conditions of rats in the model group were poor； mRNA and the content of IL-6 increased significantly， and mRNA and the content of IL-10 decreased significantly （P<0.05， P<0.01）； mRNA and protein expression of HSP70 in gastric tissues was much lower than that of normal group （P<0.05， P<0.01）. Compared with model group， generally living conditions of rats in the XSLJZ high-dose groups were improved significantly； mRNA and the content of IL-6 decreased significantly， and mRNA and the content of IL-10 increased significantly （P<0.05）； XSLJZ high-， medium-dose groups mRNA and protein expression of HSP70 in gastric tissues increased significantly （P<0.05）. Conclusion XSLJZ has protective effects on gastric mucosa of CAG rats with spleen-stomach deficiency.

Key words： Xiangsha Liujunzi Decoction； atrophic gastritis； IL-6； IL-10； HSP70； rats

慢性萎缩性胃炎（chronic atrophic gastritis，CAG）是消化系统多发疾病，病理表现为胃黏膜固有腺体萎缩、腺体细胞数量减少且伴有功能丧失，严重者伴有慢性持续性炎性反应以及肠上皮化生和不典型增生。中医认为，CAG多以脾胃虚弱，气机（或气血）失调为主要病机，故治疗多以健脾益气、理气和胃为大法。香砂六君子汤出自《古今名医方论》，是防治脾胃虚弱型CAG的有效复方。临床研究表明，运用香砂六君子汤及其加减方治疗CAG疗效显著[1-2]。本实验观察香砂六君子汤对脾胃虚弱型CAG大鼠一般生存状况，胃窦黏膜组织白细胞介素（IL）-6、IL-10分泌水平，热休克蛋白70（HSP70）基因及蛋白表达的影响，探讨该复方防治CAG的作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

健康Wistar大鼠54只，SPF级，2月龄，体质量（160±10）g，甘肃中医药大学医学实验中心，动物合格证号SCXK（甘）2011-0001-0001010。饲养于甘肃中医药大学SPF级实验室，室温（23±2）℃、湿度45%～55%，自由饮水进食。

1.2 药物及制备

香砂六君子汤以人参、白术、茯苓、陈皮、姜半夏、炒砂仁、木香、生姜、甘草按6∶12∶12∶5∶6∶5∶2∶12∶4比例配制，饮片均购自兰州复兴厚中药材有限责任公司，并经甘肃中医药大学药学院中药生药学教研室杨扶德教授鉴定合格，加10倍量蒸馏水浸泡2 h后，按常法煎煮2次，每次40 min，滤出药液加热浓缩至每1 mL药液含原药材2 g，冷却后置4 ℃冰箱保存备用，使用时稀释至所需浓度；维酶素片，新乡恒久远药业有限公司，0.2 g/片，批号20140108。

1.3 主要试剂与仪器

脱氧胆酸钠，西格玛奥德里奇上海贸易有限公司；吲哚美辛肠溶片，上海信谊黄河制药有限公司；氨水，白银良友化学试剂有限公司；乙醇，天津市富宇精细化工有限公司；IL-6、IL-10，杭州联科生物技术有限公司；β-actin、HSP70引物，宝生物工程（大连）有限公司；Trizol试剂，Promega Corporation；反转录及Real Time qPCR试剂盒，Promega Corporation；辣根酶标山羊抗小鼠IgG（H+L），北京中杉金桥生物科技有限公司；一抗HSP70，美国abcam公司。XYJ80-2离心机，广东塘厦骏越机电设备厂；DF110型电子分析天平，江苏常熟衡器工业公司；HH-4数显恒温水浴箱，江苏省金坛市友联仪器研究所；S1000TM反转录仪、Benchmark Plus酶联免疫检测仪、CFX96TM Optics Module PCR仪、BIOMATE 3S核酸蛋白测定仪、Chemi DOC XRS凝胶成像分析系统，美国BIO-RAD公司；BX51/BX52型显微镜，日本Olympus公司。

2 实验方法

2.1 造模和分组

除空白组8只大鼠正常饲养不予造模外，其余46只大鼠参照文献[3]方法造模。待综合法造模30周后，每隔1周随机抽检大鼠，取胃黏膜组织做病理检查并判定胃黏膜萎缩病理变化，评价CAG模型大鼠胃黏膜萎缩病理形成后开始治疗。将CAG大鼠按体质量编号，用随机数字表法分为模型组、阳性对照组和香砂六君子汤高、中、低剂量组（中药高、中、低剂量组），每组8只。

2.2 给药

中药高、中、低剂量组分别予24、12、6 g/kg香砂六君子汤药剂灌胃（等效剂量相当于60 kg成人剂量的12、6、3倍），阳性对照组予0.30 g/kg维酶素灌胃（相当于60 kg成人剂量的6倍），等效剂量按人与动物体型系数折算[4]。空白组和模型组予等量蒸馏水灌胃。每日给药体积均为10 mL/mg，连续120 d。

2.3 标本采集及检测

各组大鼠于末次给药后禁食不禁水24 h，乌拉坦（1 g/kg）麻醉后全部杀检。胃窦黏膜组织匀浆制备：受试大鼠麻醉处死后低温条件下快速剖取胃窦黏膜组织，以冰冷的生理盐水冲洗，滤纸吸干，称重后用眼科小剪刀尽快剪碎，置于匀浆器中，用组织重9倍生理盐水匀浆，3500 r/min离心10 min，取上清液，置于4 ℃冰箱保存，胃黏膜组织IL-6、IL-10含量测定按试剂盒说明进行操作。

2.4 实时荧光定量PCR检测胃窦黏膜组织白细胞介素-6、10基因表达

胃窦组织总RNA制备：称取大鼠胃窦黏膜组织50 mg并置于研钵中，加1 mL Trizol研磨均匀后冰上静置5 min，4 ℃、12 000×g离心5 min；移入离心管，冰上孵育5 min，加0.2 mL氯仿震荡，4 ℃、12 000×g离心15 min，取上清液，移至离心管并加0.5 mL异丙醇震荡，冰上孵育10 min，4 ℃、12 000×g离心10 min，弃上清液保留RNA沉淀物，向沉淀物中加75%乙醇1 mL，震荡后4 ℃、8000×g离心10 min，再弃上清液后室温静置干燥，加50 μL DEPC处理水溶解RNA。其OD260/OD280均在1.8～2.0之间，经总RNA琼脂糖凝胶电泳检测符合纯度要求。反转录合成模板cDNA：于0.5 mL去酶管中加入总RNA 5 μg、Random Primer 1 μL、15×Oligo dT 1 μL，再加Nuclease-Free Water至10 μL；于70 ℃变性5 min后冰上静置5 min，再按步骤加入反转录各试剂，反应混合物总体积为20 μL，短暂离心后25 ℃温浴5 min，42 ℃反应60 min，再于70 ℃、15 min灭活处理，所得单链cDNA放置于-20 ℃备用。

引物设计：从NCBI基因库中查寻目标基因ID及序列，由TAKARA公司宝生物工程（大连）有限公司设计和合成目标基因引物。IL-6引物序列上游5'-ATTTATGAACAGCGATGATGCAC-3'，下游5'-CC AGGTAGAAACGGAACTCCAGA-3'，扩增片段长度为150 bp；IL-10引物序列上游5'-CAAAGCCACAAA GCAG-3'，下游5'-AGGAGTCGGTTAGCAGTA-3'，扩增片段长度为248 bp；HSP70引物序列上游5'-CAG TTGGAGCAGCAGCAAAGA-3'，下游5'-TGAGAA TGCACGCCCATGA-3'，扩增片段长度为100 bp；β-actin引物序列上游5'-GGAGATTACTGCCCTGGC TCCTA-3'，下游5'-GACTCATCGTACTCCTGCTTGC TG-3'，扩增片段长度为150 bp。实时荧光定量PCR以β-actin为内参基因，相同模板相同基因设3个复孔、6次平行实验，得到各扩增反应的Ct值。反应体系据GoTaq 2-Step RT-qPCR试剂盒说明书配制。反应参数：预变性95 ℃、2 min，变性95 ℃、15 s，退火60 ℃、60 s，循环40次，终末延伸65 ℃、5 s。连续检测荧光并记录扩增曲线，采用样点拟合法分析得到各目的基因和β-actin的Ct值。测Ct值并分析融解曲线，以β-actin为内参，采用比较Ct值法计算相对表达量：ΔΔCt=（测试组目的基因Ct值-测试组内参基因Ct值）-（对照组目的基因Ct值-对照组内参基因Ct值），以2-ΔΔCt表示相对表达量。

2.5 蛋白免疫印迹法检测胃窦黏膜组织热休克蛋白70蛋白表达

按蛋白提取试剂盒提取组织蛋白后用BCA试剂盒进行蛋白定量，以20 μg/道上样进行SDS-PAGE电泳，转至PVDF膜，用5%牛血清白蛋白封闭后分别加入一抗。GAPDH一抗溶液配制（1∶700）：牛奶封闭液7 mL，GAPDH一抗10 μL；HSP70一抗溶液配制（1∶1000）：封闭液1 mL，HSP70一抗1 μL。4 ℃摇床过夜，洗涤后加入HRP标记羊抗小鼠二抗。辣根酶标记山羊抗小鼠（1∶7000）；二抗溶液配制：山羊抗小鼠二抗2 μL，牛奶封闭液14 mL。室温孵育1 h，采用化学发光底物进行化学发光，暗室曝光显影后用Bio-RAD Quantity one 图像分析软件进行扫描分析。

3 统计学方法

采用SPSS13.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间样本均数差异比较采用F检验，在F检验有统计学意义时，再行q检验两两比较。P<0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 大鼠一般生存状况

空白组大鼠始终表现为反应灵敏，活动及摄食量正常，被毛浓密柔顺而有光泽，粪便呈棕褐色颗粒状。CAG模型1/2数量大鼠第6周即开始出现倦卧、被毛稀疏干枯，摄食量减少；第8周后出现少食怠动、消瘦，对外界反应迟钝的病理表现，尤其随着造模时间延长，大鼠生存能力明显下降，表现为怠动少食、消瘦弓背，毛发枯槁疏散，3/4数量大鼠摄食量明显减少，容易出现眯眼蜷缩，反应迟钝，平均每日体质量增加量和摄食量明显下降。经药物干预后，中药各剂量组和阳性对照组大鼠治疗第10周开始上述症状逐渐减轻或消失，表现为反应较为灵敏，被毛疏散但有光泽，活动及饮食量正常，平均每日体质量增加量和摄食量恢复接近正常，尤其以中药高剂量组大鼠一般生存状况恢复明显。

4.2 香砂六君子汤对模型大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素-6、10基因表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠胃窦黏膜组织IL-6 mRNA表达显著升高、IL-10 mRNA表达显著降低（P<0.01）；与模型组比较，中药高剂量组和阳性对照组大鼠胃窦黏膜组织IL-6 mRNA表达显著降低、IL-10 mRNA表达显著升高（P<0.05）。结果见表1。

4.3 香砂六君子汤对模型大鼠胃窦黏膜组织白细胞介素-6、10含量的影响

与空白组比较，模型组大鼠胃窦黏膜组织IL-6含量显著升高、IL-10含量显著降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，中药高剂量组和阳性对照组大鼠胃窦黏膜组织IL-6含量显著降低、IL-10含量显著升高（P<0.05，P<0.01）。结果见表2。

4.4 香砂六君子汤对模型大鼠胃窦黏膜组织热休克蛋白70基因和蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组大鼠胃窦黏膜组织HSP70基因和蛋白表达显著降低（P<0.05，P<0.01）；与模型组比较，中药高、中剂量组大鼠胃窦黏膜组织HSP70基因和蛋白表达显著升高（P<0.05）。结果见表3、图1。

5 讨论

根据CAG临床表现如纳呆少食、运化迟滞、胃脘胀痛、形体逐渐消瘦等，其归属于中医学“痞满”“胃痞”范畴。香砂六君子汤是治疗因脾胃虚弱，湿浊内生，气机阻滞而变生“痞满”的效方，亦是体现“健脾理气和胃”治法的经典方剂。方中人参补中益气、健脾养胃；白术健脾燥湿，茯苓健脾渗湿，白术、茯苓合用，能增强健脾除湿功能，促进脾胃运化；木香、砂仁芳香健脾和胃，理气消痞而止痛；陈皮、半夏燥湿化痰，理气降逆；甘草调胃和中，具有补脾和胃、缓急止痛、调和诸药的作用。

在诸多细胞因子中，IL-6是一种具有多种功能的生物活性多肽物质，可调节T细胞活化、分化，抑制T细胞凋亡，促进肿瘤细胞增殖，并且参与白细胞趋化，加速血栓形成，在慢性炎性反应的持续发展中具有关键作用，如IL-6诱导中性粒细胞为主的炎症细胞在局部聚集，引起粒细胞呼吸爆发，生成活性氧，造成组织炎症，而活化的中性粒细胞又可分泌IL-1、IL-8、TNF-α等细胞因子，构成复杂的细胞网络，共同参与胃黏膜炎症损伤；而且有研究显示，IL-6在多种肿瘤组织中大量存在，构成了肿瘤微环境中重要的组成部分[5-6]，并在肿瘤中具有双重作用，既可通过免疫途径抑制肿瘤生长，也可通过抑制抗肿瘤因子及甲基化等方式促进肿瘤生长[7-9]。IL-10又名细胞因子合成抑制因子，是一种抗炎性与免疫抑制性细胞因子，主要由活化的单核细胞和巨噬细胞产生，IL-10可抑制炎性细胞因子和趋化因子的表达，如阻断IL-1β、IL-6、IL-12、肿瘤坏死因子-α、粒细胞-集落刺激因子和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的表达[10]，并可抑制炎性介质如一氧化氮的合成以及氧自由基的产生，在稳定胃肠道黏膜内环境中起到重要作用[11]。

近年来，在CAG黏膜损伤机制中针对具有细胞保护作用的热休克蛋白研究较多。HSP70是具有细胞保护作用的一类蛋白，广泛存在于真核和原核生物细胞中，具有维持细胞内环境稳态的生物学功能。而且HSP70分子具有与ATP较活跃的亲和性，HSP70与变性蛋白多肽结合后，依赖ATP水解释放出能量来解开多肽链的错误折叠，使其再次成熟为细胞内的正常蛋白，进而使细胞的功能和结构得到恢复[12]，对维持胃肠黏膜内环境稳态和减轻炎性反应具有重要作用；同时HSP70又可以作为一种内源性保护物质对脏器损伤产生自身保护作用，通过多种途径抑制细胞凋亡和抑制炎症，实现对机体胃黏膜的适应性细胞保护。

本研究结果显示，与空白组比较，模型组大鼠一般生存状况较差，胃窦黏膜组织IL-6 mRNA表达、IL-6含量显著升高，而IL-10 mRNA表达和IL-10含量显著降低，HSP70基因和蛋白表达水平显著降低，说明脾胃虚弱型CAG大鼠胃窦黏膜促炎和抗炎因子平衡失调，胃黏膜对炎症的免疫性和防御功能降低；与模型组比较，中药各剂量组大鼠一般生存状况明显改善，胃窦黏膜组织IL-6 mRNA表达、IL-6含量显著降低，IL-10 mRNA表达和IL-10含量显著升高，HSP70基因和蛋白表达显著升高，说明香砂六君子汤可改善脾胃虚弱型CAG大鼠一般生存状况，并通过下调胃窦黏膜IL-6水平、上调IL-10水平和HSP70的表达而发挥保护胃黏膜的作用。

参考文献：

[1] 高艳.加味香砂六君子汤治疗幽门螺杆菌相关性胃炎的临床观察[J].时珍国医国药，2011，22（5）：1283-1284.

[2] 白冬梅.香砂六君颗粒对慢性胃炎伴肠化生和不典型增生的疗效观察[J].实用中医内科杂志，2011，25（1）：49-50.

[3] 姒健敏，吴加国，曹倩，等.鼠慢性萎缩性胃炎模型的建立及致萎缩因素探讨[J].中华消化杂志，2001，21（2）：75-77.

[4] 陈奇.中药药理研究方法学[M].北京：人民卫生出版社，1993：33-34.

[5] 彭向阳，彭伟雄，黄振华，等.IL-6和MMP-9在胃癌组织中的表达及其相关性[J].中国热带医学，2012，12（8）：928-933.

[6] 韦光龙，曹维克，李龙.乳腺癌患者血清CA15-3、IL-6、TNF-α测定的意义[J].临床检验杂志，2005，23（6）：411-466.

[7] TANG L P， CHO C H， HUI W M， et al. An inverse correlation between interleukin 6 and select gene promoter methylation in patients with gastric cancer[J]. Digestion，2006，74（2）：85-90.

[8] GASCHE J A， HOFFMANN J， BOLAND C R， et al. Interleukin-6 promotes tumorigenesis by altering DNA methylation in oral cancer cells[J]. Int J Cancer，2011，129（5）：1053-1063.

[9] 李建稳，王改，申慧琴，等.IDO对胃癌细胞移植瘤中E-cadherin、N-cadherin及IL-6水平的影响[J].中国肿瘤生物治疗杂志，2014， 21（3）：334-335.

[10] STEELE C， FIDEL P L. Cytokine and chemokine production by human oral and vaginal epithelial cellsin response to Candida albicans[J]. Infect Immun，2002，70（2）：577-583.

[11] LACRAZ S， NICOD L P， CHICHEPORTICHE R， et al. IL-10 inhibits metalloproteinase and stimulates TIMP-1 production in human mononuclearphagocytes[J]. J Clin Invest，1995，96（5）：2304-2310.

[12] 杨晓鸥，钱家鸣，陈蔷.聚普瑞锌诱导HSP70保护大鼠胃黏膜损伤[J].胃肠病学和肝病学杂志，2014，23（1）：50-53.