光叶蕨孢子繁殖技术研究

陈洪连，余凌帆*，文智猷，王达兵，吴世磊

（1.四川省林业科学研究院，四川成都 610081；2.天全县林业局，四川天全 625500）

光叶蕨孢子繁殖技术研究

陈洪连1，余凌帆1*，文智猷1，王达兵2，吴世磊1

（1.四川省林业科学研究院，四川成都 610081；2.天全县林业局，四川天全 625500）

为保护仅有的野生光叶蕨资源，探索光叶蕨孢子繁殖技术，采用混合基质、无菌水、消毒原生境土、未消毒原生境土4种基质，10℃、15℃、20℃、25℃4种温度，通过人工控制光照、水分等生态因子，试验观测光叶蕨原叶体出现时间、原叶体出现总数、幼孢子体出现时间、幼孢子体总数量。结果表明：光叶蕨孢子萌发对基质的要求非常严格，最适宜在未消毒的原生境土壤中萌发。其余3种培养基质中生长的原叶体数量极少，且萌发时间较长。这可能与土壤中的微生物和酶类系统有关。光叶蕨孢子萌发的最适温度为15℃～20℃，过高或过低的温度都抑制孢子的萌发，其中在20℃条件下孢子萌发最快，可能是由于不同种类孢子的结构特征和对光照的要求不同所致。

光叶蕨；孢子繁殖；人工种群

光叶蕨（Cystoathyrium chinense Ching）为蹄盖蕨科（Athyriaceae）光叶蕨属（Cystoathyrium）植物。光叶蕨对生存和繁衍条件要求苛刻，目前仅分布于四川天全二郎山团牛坪一带，野生种群数量极少，随时面临着灭绝的危险［1］，为国家一级重点保护植物。目前对光叶蕨的研究仅限于形态学、植物资源调查及生境保护等方面［2～4］，尚未见光叶蕨孢子繁殖的报道。笔者对光叶蕨孢子繁殖技术进行了研究，以探讨光叶蕨孢子繁殖的最佳环境条件，为光叶蕨扩繁提供理论基础，对光叶蕨种群保护具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 孢子采集与储藏

于2015年8月赴光叶蕨原生境地采集孢子。将具有成熟孢子的叶片从植株上剪下，平铺在报纸上阴干，一般在3 d～7 d孢子自然散落。将混合的杂质轻轻抖落后，收集孢子于硫酸纸袋中，置于4℃冰箱保存。

1.2 孢子的灭菌消毒

用滤纸将孢子包成约2 cm2的小包，并用细线扎紧，将滤纸小包先在70%的酒精中浸20 s左右，同时用镊子将滤纸包中的气泡赶净，使孢子表面完全被酒精浸润，然后将滤纸包放入5%的次氯酸钠溶液中浸泡5 min～10 min，再用无菌水冲洗4～5次。在无菌培养皿中小心打开纸包，用少量无菌水将滤纸上的孢子冲入已消毒培养皿中备用［5］。

1.3 孢子的播种

本试验设计4种培养基质，分别为消毒的混合基质（沙∶珍珠岩∶泥炭土＝1∶1∶1）、无菌水、消毒的原生境土、未消毒的原生境土。将各处理的基质放入培养皿中整平、压实（基质厚1.2 cm左右），并加入适量无菌水。用经过灭菌的胶头滴管吸取孢子悬浮液均匀地滴入基质中。播种后盖上培养皿盖，并分别贴上标签，记录播种时间。

1.4 孢子的培养

将播种后的培养皿分别放入10℃、15℃、20℃、25℃的培养箱中，湿度通过适时加水保证培养箱湿度在90%以上，光照强度2 000 lx～2 300 lx，光源：荧光灯，每天持续时间6 h以上［6］。

播种后每天上午10点、下午2点各观察一次，控制培养箱内温度、湿度和光照，观察并记录孢子萌发、发育情况。及时清除基质中萌发的杂草和霉菌。

2 结果与分析

2.1 不同基质对孢子萌发及配子体发育的影响

从孢子繁殖结果来看，光叶蕨孢子萌发对基质的要求非常严格（表1），最适宜在未消毒的原生境土壤中萌发。孢子在未消毒原生境土壤中萌发时间最短，仅22 d就萌发形成原叶体，数量也最多。其余3种培养基质中生长的原叶体数量较少，且萌发时间较长。

在4种培养基质中只有未消毒原生境土壤培养出幼孢子体，其余3中基质均未培育出幼孢子体，说明在4种基质中只有原生境土壤适合光叶蕨配子体发育。

表1 不同培养基质中光叶蕨孢子繁殖结果

2.2 不同培养温度对孢子萌发及配子体发育的影响

根据孢子繁殖结果来看，光叶蕨孢子萌发的最适温度为15℃～20℃（表2），过高或过低的温度都抑制孢子的萌发。其中在20℃条件下孢子萌发最快，播种后22 d就能萌发。光叶蕨孢子在10℃条件下虽能萌发形成原叶体，但未能培养出幼孢子体。

表2 不同培养温度条件下光叶蕨孢子繁殖结果

3 讨论

本试验的4种培养基质中，光叶蕨孢子萌发最适宜的基质为未消毒的原生境土壤（表1）。这一结果与何圣米等的研究之间存在矛盾［7］，但与一些研究者的试验结果一致［6，8］，张祖荣等对华南黑桫椤（Gymnosphaera mettenian）、齿叶黑桫椤（Gymnosphaera denticulata）、金毛狗［Cibotium barometz（Linn.）J.Sm.］、荷叶铁线蕨（Adiataum reniforme var. sinense）的研究也指出在未消毒的原生境土壤中孢子繁殖效果最好［9～11］。试验结果说明光叶蕨孢子繁殖对其原生境土壤有较强的依赖性，并且对土壤条件要求比较严格，这也可能是其自然种群难以扩大的因素之一。光叶蕨孢子在未消毒原生境土壤中繁殖结果好于消毒的原生境土壤和混合基质的原因可能为以下两个方面：一是在土壤消毒的过程中，土壤中的微生物被高温灭杀，同时土壤里的酶类系统也被破坏，导致土壤中养分的有效性降低，这严重影响了原叶体对养分的吸收和利用；二是虽然高温杀灭了所有菌类，但是培养时温暖而潮湿的土壤中各种霉菌在所难免，从而严重影响光叶蕨孢子的繁殖过程，相反，未消毒的原生境土壤中由于长期的相互适应，土壤内的各微生物间处于相对平衡的状态，这避免了霉菌的出现，因此反而比经过消毒处理的培养基质更有利于光叶蕨孢子的繁殖［9］。由于无菌水中没有添加任何养分，不能为配子体的生长发育提供充足的营养［12］，故无菌水基质中光叶蕨的孢子繁殖结果不理想。

光叶蕨孢子萌发的适宜温度范围为15℃～20℃（表2），其中最适温度为20℃左右。这与Culcita macrocarpa孢子及铁皇冠（Microsorium pteropus）孢子的研究结果一致［13～14］，但与革叶蕨（R．adiantiformis）25℃时为最适萌发温度的研究结果不一致［15］。张正修等指出［16］，不同种类孢子的最适萌发温度存在差异，很可能是由于不同种类孢子的结构特征和对光照的要求不同所致。温度不仅可以影响孢子萌发过程中细胞膜透性与各种酶的活性，而且影响光敏色素的构型和活性。低温会限制膜透性和酶活性，从而导致孢子萌芽、配子体生长发育、孢子体的形成和生长缓慢；而高温会抑制光敏色素的活性，从而影响孢子的萌发率，导致原叶体生长不良，甚至死亡［17］。

本试验仅选择了4种基质，有一定的局限性，还有其他可能适合光叶蕨孢子繁殖的基质配方有待验证。

［1］ 朱大海，李永安，顾学清.时隔30年再现的绝灭植物——光叶蕨［J］.生命世界，2013（10）：46～47.

［2］ 余凌帆，高健，何让等.天全县光叶蕨资源现状调查与保护对策研讨［J］.四川林业科技，2015，36（3）：120～124.

［3］ 余凌帆，何让，杨梅等.天全县光叶蕨人工种群适宜生境地选择［J］.四川林业科技，2015，36（6）：17～22.

［4］ 严岳鸿，张宪春，马克平等.中国珍稀濒危蕨类植物的现状及保护［C］.第七届全国生物多样性保护与持续利用研讨会论文集.2006：77～87.

［5］ 几种观赏蕨类植物的繁殖技术研究，吴芹，南京林业大学，2007.

［6］ 赵秀芳.蕨类植物的孢子繁殖技术［J］.中国种业，2005（02）：42～43.

［7］ 何圣米，杨悦俭，徐明飞，等.紫萁孢子繁殖快速成苗技术研究［J］.Chinese Agriculturalence Bulletin，2006，22（2）：233～235.

［8］ 林证明，陈晔，韦丽娜等.二叉鹿角蕨商品化育苗技术研究［J］.江苏林业科技，1998（S1）：181～184.

［9］ 张祖荣，张绍彬.珍稀濒危黑桫椤的孢子繁殖技术初探［J］.北方园艺，2010（7）：187－190.

［10］ 张祖荣，张绍彬.国家二级保护药用与观赏植物金毛狗的孢子繁殖技术初探［J］.北方园艺，2010（13）：203～206.

［11］ 张祖荣，张绍彬.桫椤与荷叶铁线蕨的孢子繁殖技术研究［J］.安徽农业科学，2010，38（19）：10007～10009.

［12］ Momose S.Prothallia of the Japanese ferns（Filicales）［J］.University of Tokyo Press，Tokyo，1967.

［13］ Quintanilla L G，Pajarón S，Pangua E，et al.Effect of temperature on germination in northernmost populations of Culcitamacrocarpa and Woodwardia radicans［J］.Plant Biology，2000，2（6）：612～617.

［14］ 薛春丽，王卫江，高永红.铁皇冠孢子人工培养研究［J］.云南农业科技，2008（5）：16～17.

［15］ Brum F R，RandiáM.High irradiance and temperature inhibit the germination of spores of the fern Rumohra adiantiformis（Forst.）Ching（Dryopteridaceae）［J］.Revista Brasileira De Botanica，2002，25（4）.

［16］ 张正修，戴绍军.环境因子对蕨类植物孢子萌发的影响［J］.生态学报，2010，30（7）：1882～1893.

［17］ 黄超群.南京市几种蕨类植物孢子繁殖及抗旱性研究［D］.南京林业大学，2006.

Propagation Technique of Cystoathyrium chinese Spores

CHEN Hong-lian1YU Lin-fan1WEN Zhi-you1WANG Da-bing2WU Shi-lei1
（1.Sichuan Academy of Forostry，Chengdu 610081；2.Forestry Bureau of Tianquan County，Tianquan 625500）

In order to protect the resources ofwild Cystoathyrium chinense，and explore the spore propagation technique，the experimentwas conducted to observe the occurrence time and quantity of prothallium and sporophyte in 4 kinds medium（mixed media，sterile water，sterile habitat soil，and non－sterilized habitat soil）and 4 temperatures（10℃，15℃，20℃and 25℃）by artificial controlling of light，water and other ecological factors.The result indicated that Cystoathyrium chinense spore germination was very strict to the requirement of the medium.The optimalmedium for spore germination was non-sterilized habitat soil，while the quantity of prothallium was very few，and had longer germination time in othersmedium. Thismight be related to soilmicroorganisms and enzyme system.Themost suitable temperature range was 15℃～20℃，especially at20℃.The too high or too low temperaturewould inhibit the spore germination. Itmight be due to different structural characteristics of spores which had different requirements of light. Key words：Cystoathyrium chinense Ching，Spore propagation，Artificial population

10.16779／j.cnki.1003－5508.2016.04.021

S723.1

A

1003－5508（2016）04－0097－03

2016-06-18

天全县光叶蕨极小种群拯救保护生境营造及技术培训部分项目（天政采招［2014］27号）。

陈洪连（1989-），女，四川内江人，硕士生，主要从事孢子繁殖等方面的研究，E-mail：chenhonglianmcl@163.com。

余凌帆（1977-），男，四川渠县人，副研究员，现从事小种群研究与保护方面工作。