柳桉组培快繁技术体系研究

刘均利，刘海鹰，龙汉利，吴宗兴，武华卫，杨晓蓉

（四川省林业科学研究院，四川成都 610081）

柳桉组培快繁技术体系研究

刘均利，刘海鹰，龙汉利，吴宗兴，武华卫，杨晓蓉

（四川省林业科学研究院，四川成都 610081）

以柳桉（Eucalyptus saligna）成年优株萌条的带芽茎段为外植体进行了组培快繁技术体系研究。研究结果表明：利用截干的方式，可获得最佳的促萌效果，萌芽率100%，平均萌芽数38。3月下旬为柳桉组培的最佳外植体获取时间。半木质化枝条为最佳外植体选择。MS＋6－BA0.5 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1为柳桉初代诱导的最佳培养基，萌芽率66.67%。改良MS＋6－BA1.0 mg·L－1＋IBA0.02 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1为柳桉增殖培养的最适培养基，增殖系数5.44。改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋IBA0.5 mg·L－1＋NAA0.2 mg·L－1为柳桉生根的最佳培养基，生根率95%以上，平均根数9条以上。

柳桉；优树促萌；组织培养；快速繁殖

柳桉（Eucalyptus saligna），桃金娘科桉树属高大乔木，原产澳洲，是适生于受近海洋影响的亚热带以及夏季多雨气候环境的一个典型树种［1］。桉树是短周期工业原料林的首选造林树种之一，但其不同种、种源和家系之间在生产量、适应性与抗逆性上相差较大［2，3］。为了选择适宜四川地区栽培的速生抗逆耐寒桉树品种，四川省林业科学研究院于2010年从澳大利亚引进20个桉树品种71个种批号种子，育苗后在四川绵阳、合江、茂县等地营建了区域引种试验林［4］。结果表明柳桉在多地的生长均表现出快速、抗逆、耐寒等特点，发展前景广阔。为解决其优良种苗问题，林科院组培中心自2013年起从引种试验林中筛选优良单株为材料，开展了柳桉组培快繁技术研究，并取得成功。

1 试验材料和方法

1.1 试验材料

在绵阳梓潼柳桉3 a生人工林中选择树干通直、高大粗壮的优良单株，经促萌处理后，采集优株萌条为外植体进行试验。

1.2 研究方法

1.2.1 促萌技术研究

通过环割、砍口、截干等不同措施对选出的优良单株进行促萌处理（共36株）。研究不同处理方式对萌条萌发的影响，处理后观察萌芽情况，统计萌芽率，找出适宜的促萌技术，试验结果见表1。

表1 不同处理方式对优树促萌的影响

萌芽率（%）＝萌发植株数／处理的总植株数× 100

平均萌芽数＝萌发的总枝条数／处理的总植株数

1.2.2 最佳取材时间筛选

在3月下旬、7月中旬、12月下旬分别采集了柳桉优株萌条，进行统一的试验处理，消毒时间为75%酒精20 s，0.1%HgCl25 min，接种于MS培养基上，每处理接种30管，重复3次。培养30 d后统计萌芽率、污染率、褐化率，确定优株采条的最佳取材时间。试验结果见图1。

污染率（%）＝污染的外植体数／接种外植体总数×100

褐化率（%）＝褐化的外植体数／接种外植体总数×100

萌芽率（%）＝萌发的外植体数／接种外植体总数×100

图1 不同取材季节对柳桉外植体初代诱导的影响

1.2.3 最佳生理状态外植体筛选

取柳桉优树萌条茎段，分为幼嫩、半木质化、木质化3种外植体进行统一的消毒处理培养，接种于MS培养基上，每处理接种30管，重复3次。培养30 d后统计萌芽率、污染率、褐化率，确定优株采条的最佳生理状态。试验结果见图2。

图2 不同生理状态外植体对柳桉初代诱导的影响

1.2.4 初代诱导培养基的筛选

将柳桉带芽茎段接种于表2所示初代诱导培养基上，筛选出适合柳桉顶芽、腋芽萌发的最适培养基。每处理接种30管，重复3次。培养30d后统计萌芽率和生长状况。试验结果以DPS统计软件进行方差分析、新复极差检验和Duncan多重比较。

表2 初代培养试验结果

1.2.5 增殖培养基的筛选

将初代培养30 d后获得的芽体，转接到增殖培养基中（以改良MS为基本培养基）培养，以获得数量更多，生长更快速、健壮的无根苗。培养方案见表5，每个处理接种新芽茎段30个，重复3次，增殖培养3代后统计增殖系数，继代时间30 d。试验结果以DPS统计软件进行方差分析、新复极差检验和Duncan多重比较。

增殖系数＝1 cm以上带腋芽茎段切段数／每个茎段上原有腋芽数／继代次数

1.2.6 生根培养基的筛选

增殖培养30 d后，将1.0 cm以上芽苗转接到生根培养基中（以改良MS为基本培养基）培养，考察激素对柳桉生根培养的影响。培养方案见表8，每个处理接种芽苗30株，重复3次，培养30d后统计生根率和平均根数。试验结果以DPS统计软件进行方差分析、新复极差检验和Duncan多重比较。

生根率（%）＝发根的芽苗数／接种芽苗总数× 100

平均根数＝芽苗的发根数／接种芽苗总数

1.2.7 培养条件

所有培养基均附加0.7%～0.8%的琼脂；蔗糖30 g·L－1；灭菌后pH5.8；培养温度为（25±3）℃；湿度50%～70%；光照时间12 h·d－1～14 h·d－1，光照强度1 500 lx～2 000 lx。

2 结果与分析

2.1 优树促萌处理结果与分析

由表1可以看出，截干的方式，获得的促萌效果最好，但是要以砍伐掉优树为代价；砍口的方式，树体长势无明显影响，但无法获得萌条；环割的方式，能够促使优树产生萌条，效果略次于截干，但环割后对树体主体长势影响很大。如果不考虑树体主体，单从获得最多优树萌条的目的来讲，利用截干的方式是最有效的。

2.2 不同取材时间筛选试验结果与分析

取材时间对柳桉茎段萌发有着显著影响。

从图1可以看出：从3月下旬开始到7月下旬止，污染率、褐化率随着时间的推移呈上升趋势，而萌芽率却呈下降的趋势。试验结果表明，3月下旬为柳桉萌条茎段培养的最佳取材时期，在这个时期，接种的污染率、褐化率最低，分别为25.56%和10%，而萌芽率最高，为56.67%。12月下旬最不适宜柳桉茎段培养取材，其萌芽率最低且褐化率偏高，分别为14.44%和35.56%，污染率为20%；7月中旬取材，污染率最高，为58.89%，褐化率和萌芽率分别为22%和32.22%，在该时期也不宜取材。

2.3 不同生理状态外植体筛选试验结果与分析

外植体是建立快繁体系的原材料，外植体生理状态的好坏是决定能否成功进行初代诱导的关键。

从图2可以看出，柳桉幼嫩的外植体在污染率（23.33%）和褐化率（8.89%）方面都较低，但萌芽率（42%）明显低于半木质化材料的萌芽率（71.44%），这是由于幼嫩的外植体在消毒处理时容易受到消毒剂的侵害，在后期培养过程中容易死亡，且由于材料幼嫩，形态建成能力不全，从而致使萌芽率较低；而半木质化材料能更快地在培养过程形成无菌体系。而木质化的外植体由于细胞活跃度下降，萌芽率偏低且褐化率较高。

2.4 初代诱导培养基筛选试验结果与分析

将柳桉茎段洗净消毒后切成1 cm左右小段接种到初代诱导培养基上。外植体接种15 d后出现萌动，茎段叶腋处膨大鼓起，有绿色小芽冒出。经过不断生长，35 d后茎段叶腋处长出小苗。研究不同基本培养基和植物生长调节剂对外植体基部愈伤组织和增殖的影响。试验结果见表2。

从表2多重比较可知，基本培养基、6－BA和NAA各水平组合处理间，对于腋芽萌发，8号处理MS＋6－BA0.5 mg·L－1＋NAA0.1 mg·L－1呈极显著差异，萌芽率达到66.67%，且腋芽长势较好，腋芽萌发数较多，节间明显，植株高生长也比较明显；而6号处理与9号处理萌芽率均为56.67%，但比较其腋芽长势，有玻璃化的趋势，可能是由于培养基激素浓度较高，导致腋芽不正常生长。

将试验结果进行方差分析（表3），分析结果表明，基本培养基和6－BA各水平间呈极显著差异，说明基本培养基对柳桉茎段萌芽有较大影响，P值分别为0.001和0.0015。由于基本培养基各水平间和6－BA各水平间差异达到了极显著，故有必要对各水平间进行多重比较，其结果见于表4。而NAA对茎段腋芽萌发无明显影响。

表3 初代培养试验方差分析

多重比较结果（表4）表明，培养基各水平间，以MS效果最佳，平均萌芽率达到56.67%，达到极显著水平；6－BA各水平间，0.5 mg·L－1与1.0 mg· L－1间差异不显著，以1.0 mg·L－1效果最佳，根据实际试验表现来看，随着6－BA浓度的增大，萌芽率虽然提高了，但是出现了植株玻璃化现象。综合来看，6－BA为0.5 mg·L－1时，萌芽效果最佳。总的来看，MS＋6－BA0.5 mg·L－1＋NAA0.05 mg· L－1是柳桉茎段腋芽萌发的最佳培养基配方。该配方与8号试验处理结果相符，在这个处理组合中，在植株基部有少量愈伤组织，但对芽的萌发和生长并未产生不利影响，且芽的分化数多、长势好、植株生长健壮、茎叶生长正常。

表4 初代培养试验各水平间的多重比较

表5 增殖培养实验结果

2.5 增殖培养基筛选试验结果与分析

根据多重比较结果来看，5号、8号、9号处理均呈极显著差异，其中以9号处理最佳，但对比生长状况发现，8号、9号处理虽然增殖系数高，但均有明显玻璃化现象，因此可以看出5号处理改良MS＋6－BA1.0 mg·L－1＋IBA0.02 mg·L－1＋NAA0.05 mg ·L－1组合最优。为找出影响柳桉增殖效果的影响因素，对实验结果进行方差分析（表6）。

表6 植物生长调节剂对柳桉增殖影响的方差分析

方差分析结果表明，对于柳桉的增殖来讲，6－BA和NAA的P值均为0.0001，影响达到极显著水平；IBA达到显著水平，P＝0.0278。有必要对植物生长调节剂各水平间进行多重比较，比较结果见表7。

由表7可知，对于柳桉的增殖，6－BA各水平间呈极显著差异，其中以1.5 mg·L－1最佳，但此浓度下发现柳桉长势趋于玻璃化，因此需要降低其浓度，而1.0 mg·L－1下植株长势正常，1.0 mg·L－1应是更适宜柳桉增殖的6－BA浓度；对于IBA而言，3个浓度水平间差异均未达到极显著水平，但以0.02 mg·L－1平均增殖系数最高，因此IBA最适宜浓度为0.02 mg·L－1；NAA 3浓度水平间有极显著差异，其中以0.05 mg·L－1最优。综合得知，改良MS＋6－BA1.0 mg·L－1＋IBA0.02 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1组合为最佳柳桉增殖培养基配方。此结果也与5号实验处理的结果一致。

表7 植物生长调节剂各水平间的多重比较

2.6 生根培养基筛选试验结果与分析

根据多重比较结果来看，6号处理改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋IBA1.0 mg·L－1生根率与平均根数最高，分别为95.56%、9.35条。且柳桉生长势旺盛，虽然有少量侧芽生长，但不影响其生根与茎的增粗，且根系韧性好，侧根多并有根毛，利于移栽。对实验结果进行方差分析（表9）。

表8 生长调节剂对柳桉组培苗生根的影响实验结果

表9 植物生长调节剂对柳桉生根影响的方差分析

由表9可见，对柳桉的生根率影响较大的是IBA，其次为6－BA，影响最小的是NAA。IBA与6－BA对柳桉生根率影响极显著，而NAA对生根率影响显著。对柳桉生根数影响极显著的是NAA，而6－BA、IBA对其影响显著。为分析出对柳桉生根率和生根数的关键影响因素有必要对植物生长调节剂各水平间进行多重比较（表10）。

表10 植物生长调节剂各水平间的多重比较

由多重比较结果得知，对生根率而言，6－BA最优浓度为0.01 mg·L－1，IBA和NAA的最优浓度均为0.5 mg·L－1；对平均根数而言，6－BA依然是浓度为0.01 mg·L－1时最佳，IBA浓度为1.0 mg· L－1时最佳，NAA最佳浓度为0.0 mg·L－1，综合看来，柳桉生根的最佳培养基在改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋IBA0.5 mg·L－1～1.0 mg·L－1＋ NAA0.0 mg·L－1～0.5 mg·L－1的范围。我们结合后期生产，扩大接种株数，通过以改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1为基本培养基，在IBA0.5 mg·L－1～1.0 mg·L－1＋NAA0.0 mg·L－1～0.5 mg·L－1的范围内进行单因素筛选，综合考虑生根率与平均根数，确定出改良MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋IBA0.5 mg·L－1＋NAA0.2 mg·L－1为柳桉生根的最佳培养基，生根率可稳定维持在95%以上，平均根数9条以上。

3 讨论

从成年植株上采条作为外植体进行组织培养，受位置效应与成熟效应的影响，外植体的成活率一般都较低，有时甚至完全无法培养成功。因此，一般来说，萌条的采集是组培外植体的最佳选择。促萌技术的研究可为试验带来大量优质的萌条，保障组培体系能得以尽快建立。这一经验对于大多数木本植物的组培来说都是有效的。

组培体系建立的目的除保存优良种资质源外，主要是将其应用于生产，从而快速稳定的获得大量优质种苗。目前的试验配方我们均结合生产进行了摸索，可规模化推广。但随着培养次数的增多，苗木可能会出现一些退化的现象，应注意配方调整，同时进行复壮。

［1］ 祁述雄.中国桉树［M］.北京：中国林业出版社，2002.

［2］ 白嘉雨.桉树速生丰产培育技术［M］.北京：中国科学技术出版社，1993.

［3］ 黄德龙.柳桉优良家系多性状联合选择.河南科技大学学报：自然科学版，2009，30（1）：69～74.

［4］ 陈炙，杨晓蓉，刘均利，等.不同降雨型桉树种苗期特性研究［J］.桉树科技，2012，29（1）：18～24.

A Study of Tissue Culture of Eucalyptus saligna

LIU Jun-li LIU Hai-ying LONG Han-li WU Zong-xing WU Hua-wei YANG Xiao-rong
（Sichuan Academy of Forestry，Chengdu 610081，China）

Studiesweremade of tissue culture and fast propagation system of Eucalyptus saligna by taking stem segmentswith auxiliary buds from superior plants'shooting as explants.The results showed that cutting the superior plants at the trunk base could get the best effect of promoting sprouting with germination rate of 100%and average number of38 shoots.Late March was the best time to obtain explants and semi－lignified shoots were the best choice.The optimalmedium for primary induction was MS＋6－BA0.5 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1with a germination rate of 66.67%.The optimalmedium for subculture wasmodified MS＋6－BA1.0 mg·L－1＋IBA0.02 mg·L－1＋NAA0.05 mg·L－1with amultiplication coefficient of 5.44.The optimalmedium for rooting wasmodified MS＋6－BA0.01 mg·L－1＋IBA0.5 mg·L－1＋NAA0.2 mg·L－1with a rooting rate of 95%and the average root number of above 9.

Eucalyptus saligna，Promoting sprouting of superior plants，Tissue culture，Rapid propagation

10.16779／j.cnki.1003－5508.2016.04.016

S722.3

A

1003－5508（2016）04－0074－05

2016-04-10

四川省科技计划项目“林－板－家具一体化现代产业链关键技术集成研究与产业化示范”专题“速生材良种熟化及工厂化育苗技术集成与产业化示范”（2014NZ0033－1）；四川省财政专项项目“柳桉、边沁桉早期选择与无性系开发研究”（ZL2014－03）。

刘均利（1982-），女，硕士，助理研究员，主要从事林木育种和组织培养研究。