10种中药提取物体外抗传染性支气管炎病毒效果的研究

谷 颖 李 丽 王玉堃 （山东迅达康兽药有限公司 山东 济南 250300）

10种中药提取物体外抗传染性支气管炎病毒效果的研究

谷 颖 李 丽 王玉堃 （山东迅达康兽药有限公司 山东 济南 250300）

采用体外细胞培养法，研究板蓝根、大青叶、黄连、菊花、淫羊藿、人参、茯苓、黄芪、山药和当归10种中药提取物在鸡胚成纤维细胞体外培养中的最大安全浓度，借助光学倒置显微镜，肉眼观察提取物对细胞形态的影响。在安全浓度范围内分别考察各味中药对传染性支气管炎病毒标准株M41型（IBV-M41）的防治效果，确定4种抗病毒力最强的4种中药进行后续的试验。结果表明，板蓝根、大青叶、黄连和淫羊藿对IBV-M41的抗病毒效果最好。

中药提取物 鸡胚成纤维细胞 安全浓度 传染性支气管炎病毒

病毒感染是一大类严重威胁畜禽健康的疾病，且由于疫苗和抗病毒西药的大规模使用，很多病毒的毒力和抗原性发生了抗药性，使得防治病毒性疾病的难度增大。近年来，由于多种中草药及其成分有很好的抗病毒作用，且具有调节机体免疫功能、抗病毒谱广、很少产生抗药性、疗效显著等优点，正日益成为抗病毒新药的研究热点。将抗病毒中药应用到动物身上具有很大的市场前景。

鸡传染性支气管炎(IB)是由传染性支气管炎病毒(IBV)引起的一种急性、高度接触传染性呼吸道疾病，其特征是病鸡咳嗽、喷嚏以及气管发出啰音[1]。IBV变异性强，血清型多，各血清型间没有或仅有部分交互免疫，这给该病的防治带来很大的困难，而中草药抗病毒优势众多，因此中草药防治IBV成为很好的选择。对于备选的板蓝根、大青叶、黄连、菊花、淫羊藿、人参、茯苓、黄芪、山药和当归这10种中药材，分别筛选确定了提取工艺并得到各单味中药的提取物。为了研究它们的抗病毒效果，必须首先排除这些药物对细胞的直接损伤。因此，本试验将单味中药提取物稀释成一系列的浓度，然后将其和鸡胚成纤维细胞(CEF)共同培养，筛选出各自作用于鸡胚成纤维细胞的最大安全浓度。本研究针对的是由IBV-M41引起的肾型传染性支气管炎[2]，在最大安全浓度范围内探讨各个中药提取物对此病毒的防治效果，为治疗IB提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验药品 （1）板蓝根、大青叶、黄连、菊花、淫羊藿、人参、茯苓、黄芪、山药和当归购自济南中药批发市场。（2）鸡胚(11日龄，SPF胚)，购自山东家禽研究所。（3）强毒IBV-M41株由中国农业大学提供，经本实验室SPF鸡胚传代，收获尿囊液，于-70℃冰箱中保存，用前经CEF传代3次。按Reed-Muench法[3]测定IBV-M41对CEF半数组织培养感染剂量(TCID50)为10-6/0.1ml，用细胞维持液配成100TCID50浓度备用。

1.1.2 试验试剂 （1）小牛血清购自杭州四季青，56℃30min灭活，分装后于-20℃保存；胰蛋白酶(购自碧云天)消化液、D-Hanks'均自己配制。（2）MEM培养液：按照说明书，将9.4g MEM(Hyclone，SH40012-6)溶于1000ml双蒸水中，分装，高压灭菌。临用前，用10% NaHCO3调节pH至7.2～7.4，并加入5%灭活小牛血清和1%谷氨酰胺；（3）细胞维持液：同MEM培养液，但不加小牛血清。

1.1.3 试验仪器 分光光度计、超净工作台、CO2培养箱、高压蒸汽灭菌锅、离心机、光学倒置显微镜等；镊子、纱布块、小烧杯、96孔细胞培养板、24孔细胞培养板、0.22μm微孔滤器、100ml细胞培养瓶等。

1.2 试验方法

1.2.1 试验准备 （1）中药提取液的制备：采用常规水煎煮法制备10种中药的提取液，最终使提取液浓缩成1g/ml的药液(1ml溶液相当于1g生药)，3000r/ml离心20min，得上清液，药液用0.22µm微孔滤膜过滤。分装，高压蒸汽灭菌，4℃冷藏备用。（2）中药提取液的稀释：分别吸取10种中药提取物1ml至24孔细胞培养板第1孔中，然后各用等体积的细胞维持液做连续的2倍倍比稀释，从第1孔直到15孔，药物的稀释倍数分别为21～215。（3）鸡胚成纤维细胞(CEF)制备：参考文献[4-7]中方法制备CEF。取11日龄鸡胚一个于灭菌的超净工作台中，用碘酒棉球消毒蛋壳的气室部分，用镊子打开气室。取出鸡胚，剪去头，爪和内脏，将其置于培养皿中，用Hanks,液洗去血污。将组织块置于小烧杯中剪成碎块(越碎越好)，再用Hanks,液清洗2～3次。加入10ml 胰蛋白酶液在37℃水浴中消化，每隔几分钟取出摇匀，共处理30min(组织块变松散，沉降较慢时表示消化足够)。加入5ml Hanks液终止消化，混匀，静置，待沉降后倒出上清。加入5ml MEM培养液，混匀静置，待沉降后倒出上清，用8层纱布过滤。用MEM培养液将细胞悬浮计数后调整细胞密度为5×105个/ml，再分装于细胞培养瓶中，置37℃ CO2培养箱中培养24h。（4）单层CEF细胞的培养。将细胞悬液加入96孔细胞培养板中，每孔100µl，置CO2培养箱中37℃培养24h，待细胞均匀铺满单层后取出，把MEM培养液析出，用D-Hanks'液洗1遍，吸去D- Hanks'。

1.2.2 中药提取物在CEF上的安全浓度测试 （1）中药提取物对单层CEF细胞的影响：试验组各孔分别加入各浓度中药提取物100µl和细胞维持液100µl，每种药各浓度各重复4孔，同时设不加药物的对照孔4孔。用透明胶带密封，置37℃继续培养，于72h时观察细胞单层完好程度，以四孔都不发生病变的浓度为最大安全浓度。（2）单层CEF细胞形态记录方法：参考文献，“+++++”表示细胞生长最好，细胞折光性好，全部行成完整单层，无空隙；“++++”表示细胞生长较好，形成单层，基本无空隙；“+++”表示细胞生长一般，未形成单层，有较多空隙和极少圆细胞；“++”表示细胞生长较差，有大量圆细胞和空隙；“+”表示细胞很差，基本为圆细胞，极少贴壁细胞；“-”表示细胞极差，全部为未贴壁圆细胞或细胞破碎不完整或轮廓不清。

1.2.3 中药提取物对IBV的预防和治疗作用 （1）中药提取物浓度处理：以10种中药提取物最大安全浓度为起始浓度，用细胞维持液分别2倍倍比稀释成4个稀释度(21、22、23、24)。（2）先加中药提取物再加病毒：在长满单层CEF细胞的96孔板的各孔中加入中药提取物100µl，每个稀释度重复4孔，继续培养24h后，弃去各孔药液，再每孔加入100TCID50病毒液100µl。同时设病毒对照组、细胞对照组和空白对照组(没有细胞，仅在培养细胞时加100µl MEM培养液，后加细胞维持液100µl)各4孔。37℃、5%CO2培养箱中培养，每隔12h观察致细胞病变效应(CPE)变化，当病毒对照组CPE达到百分之七八十时，病变记录为终点，用MTT法[8]测定570nm下的吸光度(A570)，作为中药提取物抵抗IBV感染的指标。A570值与活细胞的生长呈正比，A570值越大，表明细胞生长越旺盛，抗感染效果越好。（3）先加病毒提取物再加中药：在含有单层CEF细胞的96孔板的每孔加入100TCID50病毒液100µl，同时设病毒对照组、细胞对照组和空白对照组，37℃、5%CO2培养箱中培养2h后，弃去各孔病毒液，每个中药提取物稀释度重复4孔，100µl/孔。（4）数据处理：取4孔的平均值，数据以“Means±SD”表示，并用SPSS软件进行多重分析。

2 结果与分析

2.1 中药提取物对单层CEF细胞的影响

由表1可以看出，黄芪提取物对单层CEF细胞的影响是最小的，最大安全浓度为26，即15.63mg/ml；其次是人参、山药，它们的最大安全浓度都是29(即1.95mg/ml)。茯苓、当归、板蓝根、大青叶、黄连、菊花和淫羊藿的最大安全浓度分别是0.976、0.976、0.976、0.976、0.488、0.488、0.244mg/ml。

表1 72h观察中药提取物对单层CEF细胞的影响结果

2.2 中药提取物对IBV的预防和治疗作用

2.2.1 中药提取物对IBV的预防作用 由表2可知，10种中药提取物在高浓度区的A570值显著高于病毒对照组(P＜0.05)，表明在安全浓度范围内中药提取物浓度越高，细胞生长越旺盛，抗感染的效果越好。在高稀释度下，中药提取物抗感染的效果不明显。结果表明，板蓝根、大青叶、黄连、菊花、淫羊藿、人参、茯苓、黄芪、山药和当归这10种中药的提取物对IBV均有一定的抵抗病毒感染的作用。

2.2.2 中药提取物对IBV的治疗作用 由表3可知，板蓝根、大青叶、黄连、淫羊藿在高浓度区的A570值显著大于病毒对照组(P＜0.05)，其它稀释度的差异不显著；其它中药提取物的A570值与对照组相比差异并不显著。结果表明板蓝根、大青叶、黄连、淫羊藿这4种中药提取物对IBV感染的细胞有比较明显的杀毒作用。

表2 中药提取物各稀释度的A570

表3 中药提取物各稀释度的A570

3 讨论

（1）试验结果表明，中药并不是完全无毒无害的，以上十种中药提取物在高浓度时能抑制细胞的生长，都对CEF细胞表现出一定的毒性，随着加入的提取物浓度的下降，毒性作用逐渐减弱。黄芪对细胞毒性作用特别小，最大安全浓度为15.63mg/ml；王志洁[9]测得黄芪对Hep-2细胞的最大无毒浓度为82.43mg/ml，高于本实验的结果，这可能是细胞种类不同，其耐受性不同所造成的。人参、山药对细胞的毒性作用也很小。此试验结果与之前刘家国[10]所得出的黄芪、当归、人参对CEF细胞毒性小具有一致性，本试验测定安全浓度时通过观察细胞形态的方法，此方法简单易行，但是划分等级粗糙，在判断细胞病变程度时不可避免的存在着主观因素。（2）体外研究抗病毒中草药的活性时，一般分三个步骤，首先利用敏感细胞进行毒种的传代，连续传代三代以上之后测定病毒对细胞的半数组织培养感染剂量（TCID50）；然后测定中草药本身对细胞的毒性；最后进行中草药体外抗病毒试验[11]。（3）先加中药后加病毒，目的是观察中药能否阻止病毒的吸附和侵入，这种方式在临床中相当于预防，可以阻止病毒吸附和进入细胞[12]，其作用机理可能是中药提取物与细胞共同作用一段时间后提高了细胞膜的稳定性，在加入病毒之后可以有效的阻止病毒的吸附和侵入。本试验结果显示，先加中药后接种病毒时，板蓝根、大青叶、黄连、菊花、淫羊藿、人参、茯苓、黄芪、山药、当归这10种中药提取物对IBV感染在高浓度时均有显著的阻断作用，提示这些中药提取物都能够抑制病毒感染，可以应用于病毒性疾病的预防。（4）先加病毒后加中药，相当于先感染细胞，然后研究中药提取物对已经进入细胞的病毒是否起作用。只有板蓝根、大青叶、黄连、淫羊藿这4种中药提取物对IBV感染有显著的治疗作用，其它中药提取物的抑制作用不明显。任宇皓等之前的研究表明，黄芪多糖和淫羊藿多糖在病毒之后加入时对NDV无明显的抑制作用[13]，可能原因是病毒不同。张素梅[14]等报道黄芪对伪狂犬病毒无抑制作用，高海汇[15]等研究表明，黄芪多糖具有较强的免疫促进作用，这些结果与本实验结果一致，即黄芪本身对病毒无杀灭作用，但它具有较强的免疫促进作用。部分中药治疗效果不明显可能是因为先接种的病毒已经侵入破坏了细胞，其抗病毒感染的能力无法恢复。

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S853.73+3

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1007-1733(2016)11-0007-03

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