异氟烷对发育期大脑的神经毒性及细胞周期的影响

丁 芳，罗 涛，王明玲，郑利民

(北京大学深圳医院，广东 深圳 518036)



异氟烷对发育期大脑的神经毒性及细胞周期的影响

丁 芳，罗 涛，王明玲，郑利民

(北京大学深圳医院，广东 深圳 518036)

目的 探讨异氟烷对发育期大脑的神经元毒性和细胞周期的影响及其相关作用机制。方法 将32只7日龄C57BL/6J小鼠随机分为4组:对照组自主吸入空气，异氟烷2 h组吸入1.3%异氟烷2 h，异氟烷4 h组吸入1.3%异氟烷4 h，异氟烷6 h组吸入1.3%异氟烷6 h。实验结束后6 h，取对照组和异氟烷6 h组小鼠脑组织，免疫组织化学方法检测半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)表达情况，FJB方法检测神经元变性情况。另取4组小鼠新鲜海马组织提取蛋白，利用Western blot免疫印迹方法检测其细胞周期蛋白CyclinB1的表达情况。结果 异氟烷6 h组海马区Caspase-3阳性细胞数及FJB阳性细胞数均明显高于对照组(P均<0.05)。异氟烷4 h组、6 h组CyclinB1表达量均明显高于对照组(P均<0.05)。结论 异氟烷可通过影响细胞周期蛋白CyclinB1表达进而引起发育期大脑海马区神经元的凋亡，并且具有一定的时间依赖性。

异氟烷；发育期；神经毒性；CyclinB1；细胞周期

异氟烷是目前临床常用的吸入麻醉药之一，具有起效快、麻醉效能高及价格低廉等优点，在儿科麻醉中使用十分广泛。但Jevtovic-Todorovic等[1]研究发现以异氟烷为代表的吸入麻醉药可以引起发育期大脑神经元的过度凋亡，减少神经元密度，从而影响认知功能。近年来的基础研究证实，吸入麻醉药也可以引起非人类灵长类动物发育期大脑的神经退行性改变，甚至可以造成动物持续至成年后认知功能障碍[2-3]。另外在新生动物如新生大鼠脑发育高峰期，使用麻醉药如七氟烷、异氟烷等作用一定时间后可能会导致神经毒性，表现为中枢神经系统组织病理学的改变，如神经细胞凋亡增多、抑制轴突发育等[4-5]。然而异氟烷引起神经毒性及神经元凋亡的具体机制尚未明确。本研究拟通过观察发育期小鼠在吸入异氟烷后其大脑海马区细胞周期蛋白CyclinB1的表达量及神经元凋亡情况，探讨其可能机制。

1 实验资料

1.1 实验动物 7日龄C57BL/6J品系健康SPF 级小鼠购自广东省医学实验动物中心(动物合格证号No:44007200018611)，雌雄不限，体质量(4±1)g。

1.2 实验仪器及试剂 异氟烷(百特公司)；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3) 一抗(CST公司)；FJB(南京科佰生物科技有限公司)；Cyclin B1一抗(CST公司)，羊抗兔二抗(Proteintech公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)、正常羊血清、二氨基联苯胺(DAB)、4%多聚甲醛等辅助试剂均购自碧云天公司，低温恒冷冻切片机。

1.3 分组及麻醉模型建立 将上述小鼠随机分为4组:对照组10只，异氟烷2 h组6只，异氟烷4 h组6只，异氟烷6 h组10只。对照组放置室温环境，自主吸入空气；异氟烷2 h、4 h、6 h组分别暴露于1.3%异氟烷中2 h、4 h、6 h。实验方法：使用德国德尔格麻醉机将密闭麻醉箱中充满麻醉气体，使用气体监护仪监测异氟烷的浓度为1.3%，等气体浓度稳定后放入实验小鼠，并保持温度36～37 ℃。麻醉过程中， 观察小鼠皮肤颜色和呼吸，直至麻醉结束。异氟烷2 h组麻醉过程中死亡1只。

1.4 免疫组化染色检测海马神经元Caspase-3表达情况 实验结束后6 h，分别从对照组和异氟烷6 h组取4只小鼠，腹腔内注射10%水合氯醛深度麻醉后，迅速开胸，分离出心脏，用一次性头皮静脉针插管至左心室，同时剪开右心耳，经左心室先灌入4 ℃预冷0.9% NaCl溶液进行快速灌洗，待右心耳流出液慢慢变得透亮，肝脏及四肢颜色发白时改用4 ℃预冷4%多聚甲醛缓慢灌注约 30 min。断头后剪开头皮去除周围组织，打开小鼠颅骨，小心取出完整大脑置于4%多聚甲醛中固定24 h，再转入20%蔗糖溶液中脱水至沉底。-80 ℃ OCT包埋剂速冻5 min后行冰冻切片，片厚25 μm。室温下干燥大脑切片，0.1 mol/L PBS溶液洗3次，每次5 min。0.01 TritonX-100破膜30 min。PBS洗3次，每次5 min，羊血清封闭1 h后，Caspase-3一抗(1∶100)4 ℃孵育过夜。PBS洗3次，每次5 min，羊抗鼠二抗(1∶200)室温下孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。DAB显色5 min，晾干、脱水、透明，中性树脂封片后拍照，用Image pro软件进行分析。

1.5 Fluoro-Jade B(FJB)染色检测神经元变性情况 取制作好的小鼠大脑海马区冰冻切片室温放置10 min，PBS洗3次，每次5 min。然后将载玻片放入染色盘，无水乙醇漂洗5 min，70%无水乙醇漂洗2 min，ddH2O漂洗2 min，0.06%高锰酸钾漂洗10 min(此时取出FJB染液)，ddH2O漂洗1 min，0.000 1% FJB漂洗10 min，反应时应尽量避免强光照射，ddH2O漂洗3次，每次1 min，吸水纸除去多余水分，用锡箔纸覆盖载玻片，部分干燥8～10 min，二甲苯漂洗1 min，用DPX封片。荧光显微镜下采用蓝色滤色片(激发光波长为450～490 nm)观察并采集图像。每只小鼠大脑海马区随机选取5个视野，对FJB 阳性细胞进行计数分析。

1.6 Western blot法检测CyclinB1表达量 实验结束后6 h，分别从4组中随机选取6只小鼠，腹腔注射10 %水合氯醛深度麻醉后，断头剪开头皮去除周围组织，打开颅骨小心取出小鼠大脑。去除脑膜及血管后，取出大脑海马区组织，于低温条件下迅速提取蛋白质。蛋白变性后，经SDS-PAGE系统电泳分离，利用蛋白条带转至PVDF膜，5%脱脂奶粉(0.1% TBST稀释)室温下封闭1 h，TBST洗涤3次，5 min/次，兔抗鼠CyclinB1单克隆抗体(1∶500)4 ℃孵育过夜，第2天取出室温放置30 min，TBST洗涤3次，5 min/次，孵育辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)室温1 h，TBST洗涤3次，10 min/次，滴加ECL发光试剂，显影、摄片。然后用Image J程序进行条带灰度分析。

2 结 果

2.1 对照组和异氟烷6 h组Caspase-3表达情况 实验结束6 h后，对照组大脑皮质、海马区仅有极少量Caspase-3 阳性细胞表达，见图1；异氟烷6 h组大脑皮质、海马区有较多Caspase-3 阳性细胞(镜下呈棕褐色)，见图2。对照组海马区Caspase-3阳性细胞数为(5.500±1.323)个，异氟烷6 h组海马区Caspase-3阳性细胞数为(27.250±3.198)个，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图1 对照组海马区及皮质Caspase-3表达情况

图2 异氟烷6 h组海马区及皮质Caspase-3表达情况

2.2 对照组和异氟烷6 h组FJB染色神经元变性情况 在荧光显微镜下，FJB阳性染色的神经元呈亮黄绿色，染色背景浅， FJB阳性染色的变性神经元主要分布在小鼠大脑皮质和海马区，其中对照组有少量的阳性细胞，异氟烷6 h组阳性细胞明显增多，见图3及图4。对照组海马区FJB阳性细胞数为(5.000±0.912 9)个，异氟烷6 h组海马区FJB阳性细胞数为(59.75±8.290)个，2组比较差异有统计学意义(P<0.05)。

图3 对照组海马区变性神经元FJB染色表现

图4 异氟烷6 h组海马区变性神经元FJB染色表现

2.3 各组CyclinB1表达情况 对照组CyclinB1表达量为100.00±17.54，异氟烷2 h组为105.3±15.78，异氟烷4 h组为148.2±23.80，异氟烷6 h组为164.9±15.35。异氟烷4 h组、6 h组CyclinB1表达量均明显高于对照组(P均<0.05)，而异氟烷2 h组CyclinB1表达量与对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。见图5。

ctrl为对照组， Iso2h为异氟烷2 h组, Iso4h为异氟烷4 h组, Iso6h为异氟烷6 h组

3 讨 论

从全麻药开始应用于临床到现在已经历了将近160年，临床上吸入麻醉药因其安全、可靠、稳定、易于控制等特性而广泛应用于产科及儿科。但研究发现吸入麻醉药对发育期的哺乳动物大脑有潜在危害，对于幼龄动物而言，全麻药的神经毒性作用在大脑发育激增期时最敏感[6]。在啮齿类动物中，大脑发育激增期主要为动物出生后14 d之内，相当于人类孕晚期至出生后两三年[7]。因此，本实验以出生7 d的小鼠作为研究对象, 通过免疫组织化学方法检测小鼠大脑海马区Caspases-3的表达情况，使用FJB染色进行变性神经元的计数,从而观察异氟烷是否可以引起小鼠海马区神经元的凋亡；并通过Western blot方法检测细胞周期蛋白CyclinB1表达情况，观察异氟烷对神经元细胞周期的影响。

Caspase-3作为蛋白水解酶可诱导细胞凋亡，在正常情况下，胞质中的Caspases-3并无活性，是以Caspase-3前体形式存在，当收到凋亡信号后被激活从而诱导细胞凋亡的发生。由于Caspase-3的激活是细胞凋亡的关键步骤[8]，不论在外源性凋亡途径，还是在内源性凋亡途径中，均需经过Caspases-3的激活才能诱导细胞的凋亡[9]。本研究发现，异氟烷6 h组新生小鼠海马区Caspases-3阳性细胞数明显多于对照组，说明1.3%异氟烷暴露6 h可以激活神经元细胞内Caspases-3，从而诱导凋亡的发生。

在神经科学的有关研究中，对于神经细胞变性坏死的检测往往是一种必不可少的方法，在过去常使用镀银染色、TUNEL染色等方法检测变性及凋亡的神经元。FJB染色与TUNEL染色有着良好的相关性，但是相较于TUNEL染色方法，FJB染色适用性更佳[10]。因此，FJB可用于标记变性的神经元，这为检测神经细胞变性坏死提供了新的技术手段。本研究中FJB染色结果显示异氟烷6 h组的新生小鼠海马区变性神经元细胞数明显多于对照组，说明1.3%异氟烷暴露6 h对新生小鼠海马区神经元细胞具有明显的损伤作用，证实了一定浓度的异氟烷暴露一定时间可以诱导发育期大脑海马区神经元细胞的凋亡。

细胞周期是指能持续分裂的真核细胞从一次有丝分裂结束后再到下一次分裂结束的循环过程，包括分裂间期和分裂期2个阶段。细胞周期的状态直接反映了细胞所处的状态，细胞周期的调控与DNA的损伤与修复关系十分密切，细胞周期蛋白主要包括周期蛋白(Cyclins)、周期蛋白依赖激酶(CDKs)、周期蛋白依赖激酶抑制剂(CKIs)。Cyclins与CDKs结合形成复合物，作用于特异的底物从而对细胞周期进行精密的调节与控制。目前已知的Cyclin家族有8个成员，即CyclinA～CyclinH。在正常情况下，细胞周期蛋白(如Cyclins、CDKs 以及CKIs)均有各自出现的时间点并且严格按照细胞周期的进程程序性表达。CyclinB表达于G2初期，在G2/M限制点达高峰，在M期末被泛素化分解去除[11]。CyclinB1是第1个被发现的细胞周期蛋白，是CyclinB家族中的成员之一，属于高度保守的蛋白家族。在神经细胞中，活性CyclinB1/CDK1复合物是启动有丝分裂的关键, 它们积累于分裂间期, 活化于分裂前期[12]。有研究证实神经元内的细胞周期蛋白的激活增多,不能引导细胞进行正常的有丝分裂，而是导致细胞周期的异常, 进而引起神经元凋亡[13]。目前已有大量研究表明，在阿尔兹海默病、脑缺血、癫痫等病理情况下，神经元的细胞周期能够重新被激活，但是其结局不是分裂增殖而是凋亡[14]。大部分的神经元因为某种因素的作用下，从静止强迫进入细胞周期的最终结局是凋亡。胚胎时期海马区有丝分裂后神经元中CDKIs的表达，可能表明了神经元正处于细胞周期停滞或是细胞分裂被阻止的状态[15]，不同于正常的增殖细胞的程序性表达，神经元细胞中细胞周期蛋白表达或激活不是规律和必要的，它们的表达和激活的过程是紊乱的。如神经元细胞和星形胶质细胞(AST)，在应对损伤性刺激时，细胞周期蛋白的激活引起神经元的细胞周期紊乱可以启动自身凋亡程序，但是对于星形胶质细胞来说，细胞周期蛋白的激活却介导了其细胞分裂增殖。以上说明细胞周期正常情况下能引起有丝分裂细胞增殖，但在神经元的细胞中则会出现截然相反的结局。目前关于其具体机制并不清楚。本研究发现，在吸入1.3%异氟烷2 h时CyclinB1的表达量与对照组比较差异无统计学意义，而在吸入1.3%异氟烷4 h、6 h时CyclinB1的表达量均明显增高,提示异氟烷促进CyclinB1的表达具有时间依赖性。与前面细胞凋亡的检测结果相呼应，提示在一定程度上发育期小鼠海马区神经元凋亡与异氟烷引起细胞周期的异常有关。

综上所述，异氟烷通过激活细胞周期蛋白造成细胞周期的异常运行，从而导致神经元的凋亡，且随着作用时间的延长凋亡越明显。但是由于神经元凋亡的复杂性，细胞周期异常引起凋亡具体机制并未十分明确。从预防的角度来看，及时干预细胞周期蛋白的表达可能会降低神经元凋亡的风险，这也为后续防治异氟烷等吸入麻醉药引起发育期大脑神经元凋亡的研究提供了新思路。

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Effects of Isoflurane on neurotoxicity and cell cycle in developing brain

DING Fang, LUO Tao, WANG Mingling, ZHENG Limin

(Shenzhen Hospital of Peking University, Beijing 518036, China)

Objective It is to investigate the effects and mechanisms of isoflurane on neurotoxicity and cell cycle in developing brain. Methods 34 seven-day-old C57BL/6J mice were randomly divided into C, A1, A2, A3 four groups：The control group (group C) inhaled air independent, Exposure to 1.3% (volume fraction) of isoflurane 2 h (group A1)；Exposure to 1.3% (volume fraction) of isoflurane 4 h (groupA2); Exposure to 1.3% (volume fraction) of isoflurane 6 h (groupA3). After the end of anesthesia for 6 hours，five mice taken respectively from the control group and experimental group. The brain tissue after cardiac perfusion with 4% paraformaldehyde were gotten to detect the hippocampus of mouse cysteine aspartic proteinase 3 (Caspase-3) expression by immunohistochemistry. Detecting the degeneration of neurons in hippocampus by using the method of Fluoro-Jade B staining. 6 mice from each groups respectively were selected and killed to get rapid extraction of hippocampal protein. Using Western blot immunoblotting method to detect the cell cycle protein B1 (CyclinB1) expression in the hippocampus of mice. Results Compared with the control group, the number of Caspase-3 positive cells and the number of degenerated neurons of the hippocampus in hippocampus of group A3 mice increased obviously (P<0.05); Compared with the control group, the expression of Cyclin B1 in group A2 and group A3 increased obviously (P<0.05), while in group A1 there was no significant difference(P>0.05). Conclusion The study found that exposure to 1.3% isoflurane for a period can increase the expression of Cyclin B1 in hippocampal neurons, then caused the changes of neuronal cell cycle and lead to apoptosis.

Isoflurane; development; neurotoxicity; CyclinB1; cell cycle

丁芳，女，硕士，研究方向为麻醉学。

罗涛，E-mail:luotao_wh@163.com

国家自然科学基金项目(81271205)；深圳市卫计委临床技术研究及转化项目(201501025)

10.3969/j.issn.1008-8849.2016.31.003

R683.2

A

1008-8849(2016)31-3427-04

2016-04-10