凝血因子Ⅶ基因多态性与颅脑创伤性凝血功能障碍的关系

栗超跃 赵黎明△ 史锡文 裴兵兵 常运光 甘 强 杜文锦

1)河南省人民医院神经外科 郑州 450003 2)河南省人民医院 郑州 450003



凝血因子Ⅶ基因多态性与颅脑创伤性凝血功能障碍的关系

栗超跃1)赵黎明1)△史锡文1)裴兵兵1)常运光1)甘 强1)杜文锦2)

1)河南省人民医院神经外科 郑州 450003 2)河南省人民医院 郑州 450003

目的 观察FⅦ基因多态性对FⅦa活性的影响，探讨FⅦ基因多态性与单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍的关系。方法 应用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性或直接PCR方法检测FⅦ多态性基因型。结果 凝血功能障碍和正常组FⅦ基因-402G/A和IVS7多态性基因型和等位基因分布差异均有统计学意义(P<0.05)。结论 FⅦ基因-402G/A多态性与血浆FⅦa活性有关，FⅦ基因-402G/A和IVS7多态性与单纯性颅脑创伤患者凝血功能障碍有关。

凝血因子Ⅶ；颅脑损伤；多态性；凝血功能障碍

凝血因子Ⅶ(FⅦ)是肝细胞分泌的一种自然状态下以单肽链的酶原形式存在的维生素K依赖性单链丝氨酸蛋白酶，水解后可活化为双肽链形式，且自身促凝活性增加。FⅦ是外源性凝血途径的具有催化活性作用的一种酶，与组织因子结合启动外源性凝血过程[1]。颅脑创伤引起脑内组织因子大量释放以及血脑屏障的开放启动了以FⅦ为核心的外源性凝血途径[2]。研究报道[3]，血浆FⅦa活性下降是单纯性颅脑创伤后发生凝血功能障碍的独立危险因素。另有研究表明[4-6]，FⅦ基因-323P0/P10、R353Q、-401G/T、-402G/A、-670A/C和IVS7多态性与急性冠脉综合征、心肌梗死以及脑卒中的易感性有关。有关FⅦ基因多态性与单纯性颅脑创伤患者血浆FⅦa活性及凝血功能障碍易感性的关系，国内外尚无相关报道。本研究旨在探讨FⅦ基因多态性与单纯性颅脑创伤后凝血功能障碍的相关性，现报告如下。

1 资料和方法

1．1 临床资料 本研究以河南省人民医院神经外科急救中心2012-03—2015-03住院的急性颅脑创伤患者为研究对象。纳入标准：(1)年龄18～<70岁；(2)明确的头部外伤史，单纯中重型颅脑创伤患者(最佳GCS 5～12分，其他部位AIS≤3)，并经头颅CT证实，发病24 h内入院；(3)受试者或其法定代表人签署知情同意。排除标准：(1)外伤后预期寿命<24 h；(2)头颅CT扫描时创伤发生时间不明或>24 h；(3)开放性颅脑损伤；(4)体质量>90 kg；(5)既往有脑部疾病(外伤性或非外伤性)伴永久神经缺陷者；(6)自身免疫性疾病；(7)急性或慢性感染性疾病。收集颅脑创伤患者877例，根据排除标准，最终240例纳入研究范围，其中凝血功能障碍108例，凝血功能正常132例。入组患者均在入院后24 h内采集空腹外周静脉血10 mL，枸橼酸钠抗凝处理后放置于-20 ℃冰箱冻存备用。

1．2 主要材料与试剂 血液基因组DNA提取试剂盒购于天根生化科技(北京)有限公司，SDS-PAGE凝胶配制试剂盒购于上海碧云天生物科技有限公司，引物合成由上海生物工程有限公司完成，Vortex Genie 2涡旋振荡器(上海迭戈生物科技有限公司)，PCR扩增仪(德国Biometrd公司)，Mini protean Ⅲ电泳仪与Bio-rad垂直电泳槽(北京伯乐生命科学发展有限公司)。

1．3 PCR-RFLP方法检测入组患者FⅦ基因型 引物合成和PCR反应体系设计参考文献[1-2，7-9]，本研究选用浓度为2%的琼脂糖凝胶，通过琼脂糖凝胶电泳检测目的片段PCR扩增产物。FⅦ基因多态性目的片段经PCR扩增后，PCR产物需要进一步经限制性内切酶酶切鉴定。取经琼脂糖凝胶电泳检测扩增良好的PCR产物6 μL，加入对应的限制性内切酶配成酶切反应体系，在适宜温度下恒温孵育。最终将染色后的聚丙烯酰胺凝胶置于紫外检测仪下观察并用凝胶成像分析系统摄影。

2 结果

2．1 血浆FⅦa活性与FⅦ基因多态性的关系 血浆FⅦa高活性组与低活性组患者FⅦ基因多态性分析结果见表1。

表1 血浆FⅦa活性与FⅦ基因多态性的相关性

血浆FⅦa高活性组与低活性组患者-402G/A多态性基因型GG402、GA和AA的频率分布差异有统计学意义(P<0.05)，等位基因G和A的频率分布也有显著性差异(P<0.05)，FⅦ基因-402G/A多态性与血浆FⅦa活性有关。GG402基因型携带者血浆FⅦa活性相对高于AA基因型携带者，等位基因G402可能对维持血浆FⅦa处于较高水平有促进作用；而FⅦ基因-323P0/P10、R353Q、-670A/C和IVS7多态性基因型和等位基因的频率分布与血浆FⅦa活性均无相关性。

2．2 凝血状态与FⅦ基因多态性的关系 单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍和凝血功能正常患者与FⅦ基因多态性的相关性分析结果见表2。

表2 单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍与FⅦ基因多态性的相关性

单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍和凝血功能正常患者FⅦ基因-402G/A和IVS7多态性对应基因型GG402、GA、AA和H7H7、H7H6、H6H6的频率分布差异有统计学意义(P均<0.05)，等位基因G402、A和H7、H6的频率分布也有显著性差异(P均<0.05)。FⅦ基因-402G/A和IVS7多态性可能与单纯性颅脑创伤后凝血功能障碍的发生率有关。单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍和凝血功能正常患者FⅦ基因-323P0/P10和-670A/C多态性基因型和等位基因的频率分布与单纯性颅脑创伤后凝血功能障碍的发生率无相关性。

3 讨论

FⅦ基因-402G/A[2]多态性属于DNA单核苷酸多态性，是由于FⅦ基因402处鸟嘌呤核苷酸(G)被胸腺嘧啶核苷酸(T)置换。IVS7多态性则是指FⅦ基因第7内含子区域第4高变区(HVR4)中不同拷贝数的重复序列，也可称为HVR4多态性，是一种DNA重复序列多态性，其重复序列为37 bp(5'-CTGGGTGGGTACCACTCTCCCCTGTCCGACCGCG GTG-3')，该基因多态性于1991年由Marchetti等首次报道。目前认为，-402G/A多态性影响血浆FⅦ水平的可能机制是由于启动子区域该位点的1个等位基因的碱基发生颠换，改变了FⅦ基因正常序列。IVS7多态性是由于重复序列而影响FⅦ基因mRNA的剪接，影响mRNA的转录活性，从而使血浆FⅦa活性下降[9]。目前大多数研究认为，与H6H6多态性相比，H7H7多态性与血浆较低FⅦa活性相关[4，9]。

本研究结果显示，尽管FⅦ基因-402位点G/A多态性基因型和IVS7位点H6H6基因型携带者血浆FⅦa活性最高，但分别与GG402、AA402和H7H7、H7H6基因携带者之间血浆FⅦa活性无显著差异；但血浆FⅦa高活性组与低活性组患者及单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍和凝血功能正常患者-402G/A多态性基因型GG402、GA和AA402的频率分布差异均有统计学意义，提示FⅦ基因-402G/A多态性与血浆FⅦa活性和单纯性颅脑创伤后凝血功能障碍的发生率有关，GG402基因型携带者血浆FⅦa活性相对高于AA基因型携带者，而且GG402基因型携带者颅脑创伤后发生凝血功能障碍的几率也相对低于AA402基因型携带。因此认为，等位基因G402可能对维持血浆FⅦa处于较高活性有促进作用，同时提示等位基因G402可能对降低单纯性颅脑创伤后发生凝血功能障碍具有积极作用，可能是单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍的保护性基因。

IVS7仅仅在单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍和凝血功能正常患者基因型和等位基因的频率分布存在显著性差异，其中H6H6基因型携带者颅脑创伤后发生凝血功能障碍的几率相对低于H7H7基因型携带者，同时提示等位基因H6可能对降低单纯性颅脑创伤后发生凝血功能障碍具有积极作用，可能是单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍的保护性基因。

虽本研究结果表明FⅦ基因-402G和IVS7与血浆FⅦa水平和单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍有关，但同时也与既往研究结果存在差异，造成这种差异的原因可能是多方面的，但主要原因可能是研究对象和研究方法的差异。本研究只分析了单一位点多态性与单纯性颅脑创伤后凝血功能状态的关系，而未联合分析2个或多个位点多态性对单纯性颅脑创伤后凝血功能状态的影响，故需进一步研究。

综上所述，FⅦ基因-402G/A多态性与血浆FⅦa活性有关，等位基因G402可能对维持FⅦa处于较高活性有促进作用；FⅦ基因-402G/A和IVS7多态性与单纯性颅脑创伤后凝血功能障碍的发生率有关，等位基因G402和H6可能对降低单纯性颅脑创伤后发生凝血功能障碍具有积极作用，可能是单纯性颅脑创伤性凝血功能障碍的保护性基因。

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(收稿 2016-01-20)

国家自然科学基金资助项目(No. 81273175)

R651.1+5

A

1673-5110(2016)19-0038-03

△通讯作者：赵黎明，Email：zhaoliming1201@126.com