北京地区连作草莓根际土壤中真滑刃线虫的鉴定

李星月， 白春启， 刘奇志， 李贺勤， 张 鸿

(1.四川省农业科学院 植物保护研究所，农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，四川 成都 610066； 2.中国农业大学 植物保护学院，昆虫与线虫实验室， 北京 100193； 3.河南工业大学 粮油食品学院，粮食储运国家工程实验室，河南 郑州 450001； 4.青岛农业大学 农学与植物保护学院，山东省旱作农业技术重点实验室，山东 青岛 266109)



北京地区连作草莓根际土壤中真滑刃线虫的鉴定

李星月1，2， 白春启3， 刘奇志2，*， 李贺勤4， 张 鸿1

(1.四川省农业科学院 植物保护研究所，农业部西南作物有害生物综合治理重点实验室，四川 成都 610066； 2.中国农业大学 植物保护学院，昆虫与线虫实验室， 北京 100193； 3.河南工业大学 粮油食品学院，粮食储运国家工程实验室，河南 郑州 450001； 4.青岛农业大学 农学与植物保护学院，山东省旱作农业技术重点实验室，山东 青岛 266109)

对北京地区连作草莓土壤中占种群优势地位的真滑刃线虫Aphelenchussp.，采用传统形态学和分子生物学相结合的手段进行了鉴定。结果表明，文中分离得到的真滑刃线虫，虫体形态与燕麦真滑刃AphelenchusavenaeBastian极为相似，且主要形态学测量值基本相符。在形态学鉴定结果的基础上，结合ITS-rDNA区域序列扩增结果与GenBank已注册的序列比对分析，确定该线虫为燕麦真滑刃线虫。该线虫的分类鉴定为其生物学及生态学特性的深入研究奠定了基础，但由于该线虫在连作草莓的根际土壤中大量存在，其是否对草莓的生长有不利影响值得进一步探讨。

连作草莓；分类鉴定；食真菌线虫；燕麦真滑刃线虫

草莓(FragariaananassaDuch.)是蔷薇科草莓属的宿根性多年生草本植物，原产于欧洲， 以其柔软多汁、营养丰富而著称，素有“水果皇后”的美称[1]。草莓产业在我国长期以来保持着大规模的种植水平，并呈现出稳定增长的趋势。据统计，我国草莓种植面积已达10万hm2，种植面积和产量均居世界第一位[2]。大面积的推广种植使草莓成为许多植物寄生线虫的适宜寄主，一些世界各地广泛分布的种类或当地特有的线虫种类都影响着草莓的生长。线虫对草莓的为害通常是一种隐蔽危害，大多只在根部或生长点附近寄生，起初通常表现为植株生长衰弱，但在严重时，会导致匍匐茎繁殖能力下降，产量明显降低甚至绝收[3]。此外，土壤中食微线虫以食细菌线虫和食真菌线虫为主，两者同时也是土壤中线虫主要营养类群，达到土壤自由生活线虫80%[4-5]，不同的农业系统中食细菌线虫和食真菌线虫在土壤中线虫比例不同[6]，在不同管理的农田土壤中食细菌线虫的相对多度可达26.6%～76.6%，食真菌线虫的相对多度可达2.5%～34.4%[7]。前期对不同连作年限草莓温室土壤线虫优势度及营养类群结构进行研究发现，草莓非连作地点土壤食真菌线虫与连作地点土壤食真菌线虫差异明显[8]。为了进一步分析研究该类线虫，本研究以分离过程中在食真菌线虫占绝对优势的真滑刃线虫(Aphelenchussp.)为对象，以传统形态学和分子生物学为手段鉴定到种，明确了该类线虫分类地位，为该线虫的生物学及生态学特性研究奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试剂及溶液配制

试剂：2.5 mmol·L-1MgCl2，Tween-20，75% 乙醇，0.5 mol·L-1EDTA，Tris，HAc，dNTP，Proteinase K，Taq酶等(北京强辛博瑞生物技术有限公司)；线虫固定液TAF：以每100 mL含 2 mL三乙醇胺、7 mL甲醛(38%～40%)和91 mL蒸馏水配制；也可采用固定液FA，以每100 mL含10 mL甲醛(40%)、1 mL冰醋酸和89 mL蒸馏水配制。

线虫基因组提取缓冲液Ⅰ：以1 mL记，含PCR 水 (mili-Q 水) 885 μL，1×PCR 缓冲液含 MgCl2100 μL，1% Tween-20 10 μL，100 μg·mL-1Proteinase K 5 μL；PCR体系反应液Ⅱ：以1个反应体系记，含PCR 水 (mili-Q 水) 14.5 μL，1×PCR 缓冲液含 MgCl22.5 μL，dNTP 2 μL，上游引物1.5 μL，下游引物1.5μL，Taq酶0.2 μL，DNA模板2 μL；琼脂糖凝胶Ⅲ：以200 mL记，含0.4 g琼脂糖，40 mL 1×TAE，4 μL GoldViewTM；10×PCR 缓冲液： 100 mmol·L-1Tris-HCl (pH 8.3)，500 mmol·L-1KCl，15 mmol·L-1MgCl2；50×TAE： Tris 121 g，HAc 28.55 mL，0.5 mol·L-1EDTA 50 mL，pH 8.0。

1.2 线虫的分离与培养

采用浅盘—贝曼漏斗法[9]，对2012—2013年北京市农林科学研究院林业果树研究所连作草莓根际采集的土壤进行线虫分离，再将其食真菌线虫中的优势线虫——真滑刃线虫Aphelenchussp.单条分离出来，经体表消毒后接种到已经长满灰葡萄孢真菌Botrytiscinerea菌丝的马铃薯蔗糖培养板上，进行线虫纯化培养，用于线虫形态学及分子鉴定[3]。

1.3 线虫杀死固定与形态学鉴定

纯化培养的真滑刃线虫用热水浴(65 ℃，3～5 min)杀死， 接着用4%甲醛固定液固定，将已固定的线虫制成临时玻片，置于光学显微镜下进行形态鉴定，并进行测量和拍照。线虫的鉴定分类参照《Soil and fresh water nematodes》[10]《中国土壤动物检索图鉴》[11]《植物线虫分类学》[12]和《植物线虫志》[13]等工具书，形态测量采用De Man公式[14]。中各字母代表如下：n(number of speciments)为所测线虫个体数；L(body length)为虫体体长，μm；W(greatest body width)为虫体最大体宽，μm；T(tail length)为虫体尾长，μm；St(stylet length)为口针总长，μm；a(body length/ greatest body length)为体长/最大体宽；b(body length/ distance from anterior end to junction of oesophagus and intestine)为体长/体前端至食道与肠连接处的距离；c(body/tail length)为体长/尾长；c’(tail length/anus body width)为尾长/肛门处体宽；V(distance form vulva to anterior end×100/body length)为体前端至阴门的距离×100/体长。

1.4 线虫rDNA提取

取经纯化培养线虫若干条，置于已用75%乙醇消毒的载玻片上，用灭菌水反复冲洗，然后挑取置0.5 mL Eppendorf中；将提取基因组rDNA 缓冲液Ⅰ加入上述Eppendorf中，然后放入-20 ℃冰箱中保持20 min(或-80 ℃冰箱中保持10 min)；取出Eppendorf在65℃水浴中保持1 h；将Eppendorf置于95 ℃水浴中保持1 min灭活蛋白酶K，立即放置冰浴冷却；将上述Eppendorf在11 600g条件下，常温离心2 min，收集上清液，即为线虫rDNA悬浮液；将rDNA保存在-20 ℃用于PCR试验(若长期保存保存在-80 ℃)。

1.5 线虫ITS区扩增引物

选取4对ITS区通用引物，由北京六合华大基因科技有限公司合成，引物序列如下[15-17]：第1对引物。上游引物18S (5’-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3’)，下游引物26S (5’-TTT AGC CGA GTG ATC CAC CG-3’)。第2对引物。上游引物rDNA2 (5’-TTG ATT ACG TTC CCT GCC CTT T-3’)，下游引物rDNA5.8S (5’-ACG AGC CGA GTG ATC CAC CG-3’)。第3对引物。上游引物S-ITS-1 (5’-TTG ATT ACG TCC CTG CCC TTT-3’)，下游引物P28S (5’-TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG-3’)。第4对引物。上游引物AB28 (5’-ATA TGC TTA AGT TCA GCG GGT-3’)，下游引物TW81(5’-GTT TCC GTA GGT GAA CCT GC-3’)。

1.6 PCR扩增程序

预变性94 ℃，1 min；变性94 ℃，30 s；退火57 ℃，1 min；延伸68 ℃，1 min；共35个循环，最后1个循环结束后，延伸72 ℃，2 min。

1.7 琼脂糖凝胶电泳

将rDNA的PCR产物，与2%琼脂糖凝胶在100 V稳压电泳，分离30～40 min，完毕后在紫外透射仪上观察、拍照。

1.8 PCR产物回收、纯化、测序

切下琼脂糖凝胶上的DNA条带，用凝胶纯化试剂盒进行DNA回收纯化，序列测定由北京六合华大基因科技有限公司完成。

1.9 数据分析

线虫的形态学测量数据采用SPSS 17.0 软件进行分析。DNA扩增产物序列测定后，采用Contig Express、DNAMAN等生物信息软件结合GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 数据库Nucleotide Blast序列比对进行分析。

2 结果与分析

2.1 形态学鉴定

形态特征描述：未见雄虫，雌虫如图1，身体向前逐渐变细，头平圆，尾短柱状，末端半圆。除头部外体表有环纹，侧区有12条侧线。口针无基部球，前食道呈筒状，与卵形食道球相接，食道球直径接近体宽，中间含有显著月牙形瓣膜。食道腺位于食道球后，通过环绕有神经环消化道与食道球连接。肠通过大约1.5倍体宽的峡部与食道球相连，食道腺后端，卵巢前伸，卵巢后为卵囊，约等于体宽。阴门横裂，稍向前倾斜，位于体中后部72%～79%处，阴门唇突起。

测量值见表1。结合文献描述比较，尾长/肛门处体宽c’值的测量为1.1±0.2(0.7～1.5)，略低于谢辉等1999年关于番茄、芥菜等寄主种群文献描述值2.3(2.0～2.8)[14]，口针总长St的测量值18.1±0.9 (16.1～20.1)，略大于Goodey 等于1965年关于草皮寄主种群的描述值14.6(14～15)[18]，略大于谢辉等1999年关于番茄、芥菜等寄主种群文献描述值15.0(13.0～15.6)[14]，其他测量特征值落在文献描述特征值基本相符，因此，依据形态特征，鉴定为燕麦真滑刃(AphelenchusavenaeBastian， 1865)。分类地位：燕麦线虫(AphelenchusavenaeBastian， 1865)，滑刃目(Aphelenchida)，滑刃亚目Aphelenchina，真滑刃总科(Aphelenchoidea)，真滑刃科(Aphelenchidae)，真滑刃属(Aphelenchus)。

A～E. 本文的燕麦真滑刃线虫，A—整体，B—前部，C—中部，D—阴门，E—尾部；F～G. Aphelenchus avenae Bastian, 1865[18]，F—整体，G—前部图1 燕麦真滑刃线虫(雌虫)形态光学显微镜照片与文献描绘图比较Fig.1 Morphological comparison of Aphelenchus avenae (female)

表1 北京连作草莓土壤中真滑刃线虫与其他文献已描述的种群测量值比较

Table 1 Comparative female morphometrics ofAphelenchussp. from continuous-cropping strawberry rhizosphere soil in Beijing and other related species from literatures

特征值北京(本文)文献Ⅰ[18]文献Ⅱ[14]n201710L/μm755.6±61.1(627.6-883.6)670(551-858)640(560-740)W/μm27.0±4.6(17.4-36.6)——St/μm18.1±0.9(16.1-20.1)14.6(14-15)15.0(13.0-15.6)T/μm28.1±3.2(21.3-34.8)——a28.5±3.1(21.9-35.0)33(25-39)34(31-39)b5.3±0.4(4.4-6.2)8.3(7.2-9.2)6.6(6.0-7.1)c27.2±3.2(20.5-33.9)31(27-35)26(23-31)c'1.1±0.2(0.7-1.5)—2.3(2.0-2.8)V76.0±1.0(74-78)76.5(74-78)76(75-78)

注：—表示该文献内未检测该指标。

2.2 分子鉴定

ITS-PCR扩增结果表明，如图2，第1对引物和第3对引物扩增产物大小均在1 000 bp左右，第2对引物和第4引物扩增产物大小均在750 bp左右，在阴性对照中没有PCR产物。将滑刃线虫Aphelenchussp.用第2引物(rDNA2和rDNA5.8S)扩增产物进行序列测定，产物大小为474 bp，再将该序列在GenBank上进行Blast同源性检索，发现同源性最高的为1999年Iwahori等在GenBank注册的Aphelenchusavenae(登录号AF119048.1，长度为683 bp)，相似度为100%，如图3。与Holterman等在GenBank注册的A.avenaeApheAve2品系(登录号AY284640.1，长度为1594 bp)的相似度也为100%。与Okada和Kadota在GenBank注册的A.avenaeAaF(登录号AB368919.1，长度为631 bp)、Bert和Kumari在GenBank注册的A.avenae33SR(登录号JQ348399.1，长度为1 695 bp)的相似度均为99%。

M: DL2000标准DNA；1: 第1对引物；2: 第2对引物；3: 第3对引物；4: 第4对引物；5: 阴性对照图2 北京连作草莓土壤中真滑刃线虫4对引物的ITS-PCR扩增产物凝胶电泳图Fig.2 Gel electrophoresis fragments of Aphelenchus sp. in continuous-cropping strawberry rhizosphere soil from Beijing by ITS-PCR

将滑刃线虫Aphelenchussp.用第4对引物(AB28和TW81)扩增的产物进行序列测定，产物大小为609 bp，再将该序列在GenBank上进行Blast同源性检索，发现同源性最高的为Iwahori等在注册的A.avenae(登录号AF119048.1，长度为683 bp)，仅有一个碱基不相同，相似度为99%，如图4。

图3 北京连作草莓土壤中真滑刃线虫Aphelenchus sp.的ITS-rDNA(rDNA2和rDNA5.8S引物扩增)序列对比结果Fig.3 Comparison of ITS-rDNA sequence of Aphelenchus sp. in continuous-cropping strawberry rhizosphere soil from Beijing and Aphelenchus avenae (ID: AF119048.1)from GenBank

图4 北京连作草莓土壤中真滑刃线虫Aphelenchus sp. 的ITS-rDNA(AV28和TW81引物扩增)序列对比结果Fig.4 Comparison of ITS-rDNA sequence of Aphelenchus sp. in continuous-cropping strawberry rhizosphere soil from Beijing and Aphelenchus avenae (ID: AF119048.1) from GenBank

3 讨论

本研究分离得到草莓连作土壤中的真滑刃线虫与Goodey等[18]于1865年报道的燕麦真滑刃AphelenchusavenaeBastian极为相似，且2种线虫的主要形态特征基本相符。结合该线虫与文献的形态测量值比较，虽然在形态鉴定过程中，形态测量数值与文献报道的测量数值存在部分不一致，主要是线虫的虫体体长(L)和口针总长(St)较燕麦真滑刃略长，但是测量值基本在文献报道测量数值的波动范围内，而这种线虫的种群测量值之间的差异， 可能属于种内不同的地理种群之间的差异。通过ITS-rDNA区域序列扩增结果分析，引物rDNA2/rDNA5.8S和AB28/TW81的特异性强，经测序及序列比对与燕麦真滑刃的相似度很高，因此，结合形态鉴定特征，鉴定该真滑刃线虫为燕麦真滑刃线虫Aphelenchusavenae。

前期研究表明，燕麦真滑刃的食性是取食真菌的，分类地位为滑刃亚目Aphelenchina，真滑刃科(Aphelenchidae)[11，19]。燕麦真滑刃线虫在世界各地都有分布，美国、法国、中国、意大利、印度、加拿大、菲律宾等国家都有报道过燕麦真滑刃线虫，且该线虫宿主范围非常广。在我国，前人在厦门地区草莓、丝瓜、油菜等植株根部都发现过燕麦真滑刃线虫[3，8]。虽然，有研究表明多次于腐烂的植物组织中发现燕麦真滑刃线虫，能够在愈伤组织上繁殖，并可用烟草愈伤组织培养燕麦真滑刃线虫，表明其能够在健康组织存活并具有寄生性[20-21]，但进一步的研究认为该线虫对高等植物并无危害[22]。

国内外将燕麦滑刃线虫作为食真菌线虫的代表来研究线虫对土壤氮矿化、植物生长及真菌的影响这方面的报道比较多[23-25]。有研究表明了燕麦真滑刃线虫常被发现在腐烂根中是因为它们以腐烂根上的真菌菌丝为食[18]。它是一种食真菌的线虫，但在一些极端情况下也能取食一些植物[3]。由此可以看出，该线虫生物学特性还存在不同的观点，因此其生物学和生态学特性有待进一步研究，而准确鉴定该线虫分类地位是重要环节之一。

此外，国内外相关研究报道证明，与真滑刃属(Aphelenchus)同为滑刃目(Aphelenchina)的滑刃属(Aphelenchoides)线虫，草莓滑刃线虫(Aphelenchoidesfragariae)是为害草莓生产的重要病原之一， 会引起草莓春矮病的发生，且该病分布世界各地[3，8]。此外，徐建华等[26]对江苏、浙江和上海主要草莓种植区的寄生线虫种类和发生情况进行了调查，结果鉴定出能引发草莓夏矮病的贝西滑刃线虫(Aphelenchoidesbesseyi)。燕麦真滑刃线虫在连作草莓的根际土壤中大量存在，是否对草莓的生长有不利影响也值得进一步探索。

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(责任编辑 张 韵)

Identification ofAphelenchussp. in continuous-cropping strawberry rhizosphere soil from Beijing

LI Xing-yue1，2， BAI Chun-qi3， LIU Qi-zhi2，*， LI He-qin4， ZHANG Hong1

(1.KeyLaboratoryofIntegratedPestManagementonCropsinSouthwest，InstituteofPlantProtection，SichuanAcademyofAgriculturalSciences，Chengdu610066，China; 2.LaboratoryofEntomologyandNematology，CollegeofPlantProtection，ChinaAgriculturalUniversity，Beijing100193，China; 3.NationalEngineeringLaboratoryforGrainStorageandLogistics，SchoolofFoodScienceandTechnology，HenanUniversityofTechnology，Zhengzhou450001，China; 4.ShandongProvincialKeyLaboratoryofDrylandTechnology，CollegeofAgronomyandPlantProtection，QingdaoAgriculturalUniversity，Qingdao266109，China)

Aphelenchussp.，a dominant nematode species in Beijing continuous-cropping strawberry soil， was identified in present study by morphological and molecular methods. The results showed that its morphology was extremely similar withAphelenchusavenaeBastian. Besides， the main morphological measurements ofAphelenchussp. andAphelenchusavenaeBastian were consistent. On the basis of morphological identification results， combining with ITS rDNA regional sequence amplification results with GenBank registered sequence alignment analysis， it was determined thatAphelenchussp. was a new strain ofAphelenchusavenae. The identification ofAphelenchussp. laid a solid foundation for the further study of its biology and ecology characteristics. SinceAphelenchussp. existed in large numbers in the rhizosphere soil of continuous-cropping strawberry， it’s needed to carry out further research to know whether it have adverse effect on the growth of strawberry or not.

continuous-cropping strawberry; taxonomic identification; fungivorous nematode;AphelenchusavenaeBastian

10.3969/j.issn.1004-1524.2016.06.18

2015-10-16

国家科技支撑计划项目(2014BAD16B07-2)；农业部公益性行业(农业)科研专项(201503127)

李星月(1987—)，四川内江人，博士，助理研究员，从事有害生物综合防治研究。E-mail：michelle0919lee@126.com

*通信作者，刘奇志，E-mail：lqzzyx163@163.com

S436.639

A

1004-1524(2016)06-1018-07

李星月， 白春启， 刘奇志，等. 北京地区连作草莓根际土壤中真滑刃线虫的鉴定[J].浙江农业学报，2016，28(6)： 1018-1024.