APP下载

鸡致病性大肠杆菌16S rRNA PCR鉴定方法的建立

2016-11-28徐睿季芳李梦龙

现代畜牧兽医 2016年7期
关键词:致病性雏鸡菌落

徐睿,季芳,李梦龙

(1.西昌学院动物科学学院,四川 西昌 615013;

2.四川省凉山州德昌县农牧局饲料监测站,四川 德昌 615500)

鸡致病性大肠杆菌16S rRNA PCR鉴定方法的建立

徐睿1,季芳2,李梦龙1

(1.西昌学院动物科学学院,四川 西昌 615013;

2.四川省凉山州德昌县农牧局饲料监测站,四川 德昌 615500)

为了建立一种鸡致病性大肠杆菌的快速检测方法,本试验通过无菌采集疑似感染致病性大肠杆菌鸡的心、肝、脾、肾作为病料,经过细菌分离培养、生化鉴定和致病力试验,利用大肠杆菌16S rRNA通用引物对3株致病菌进行PCR扩增,均得到了特异性扩增产物。并对扩增产物进行核酸测序和BLAST比对。结果显示,分离得到3株鸡致病性大肠杆菌(DZMG、DGCG1、DGCP3),扩增出的16S rRNA基因序列与鸡致病性大肠杆菌基因序列同源性为100%。提示该检测方法具有特异性高和简单快捷的特点。

鸡致病性大肠杆菌;分离培养;16S rRNA;PCR鉴定

鸡大肠杆菌病是一种在特定情况下由某些致病性大肠杆菌引起鸡发病或死亡的细菌性传染病,是一类禽类急性和全身性疾病,病型复杂,对养鸡业造成极大危害和重大经济损失[1]。禽致病性大肠杆菌属于埃希菌属,为直杆菌,革兰氏阴性,无芽孢,属于兼性厌氧型,常以散在或成对的形式存在[2]。鸡大肠杆菌病会引起鸡的心包炎、肝周炎、气囊炎、输卵管炎、腹膜炎、肺炎、肉芽肿和全眼球炎等[3],严重时甚至引起菌血症、急性败血症导致鸡死亡。因此,建立一种有快速、准确、有效的检测方法对预防和治疗该病尤为重要。

16S rRN A素有“细菌化石”之称,16S rRN A存在的保守区为所有的细菌所共同拥有,具有十分高的保守性,因此,通过设计细菌通用引物是可以将此实现菌种鉴定的[4]。PCR技术具有高特异性、高灵敏度和操作简易等诸多特点,目前它已经被广泛应用于食源性致病菌检测技术的研究和开发[5]。本次试验利用PCR技术和16S rRN A保守性高的这些特点,建立一种鸡致病性大肠杆菌16S rRN A PCR快速鉴定方法。

1 试验材料

1.1试验器材解剖器材、显微镜恒温培养箱、高压蒸汽灭菌锅、超净工作台、PCR仪、电泳仪、琼脂凝胶成像系统等。

1.2药品和试剂营养肉汤培养基、麦康凯培养基、伊红美蓝培养基、营养琼脂培养基(购自杭州滨和微生物试剂有限公司)、革兰氏染色液试剂盒(购自青岛高科园海博生物技术有限公司)、生化发酵管(购自杭州微生物试剂有限公司提供)、M IX(Taq DN A聚合酶、dN TPs、缓冲液)、DL2000DN A M arker、琼脂糖凝胶DN A回收试剂盒(购自北京天根生物科技有限公司)。

大肠杆菌ATCC35218(DZK)、金黄色葡萄球菌ATCC29213(J ZK)、乙型副伤寒沙门氏菌CM CC50094(SZK)、肺炎克雷伯氏菌CM CC46117(KZK)标准菌株购于中国兽医监察所。

2 试验方法

2.1病料采集从西昌市周边3个养鸡场(编号为XN、GC、ZM)中采集的疑似病鸡在无菌条件下取出的心(X)、肝(G)、脾(P)、肾(S)作为病料。

2.2病原菌分离鉴定

2.2.1病原菌分离培养无菌采集病料深部组织接种于营养琼脂培养基,37℃,培养16~24 h,挑取典型菌落2~3个接种于伊红美兰培养基和麦康凯培养基,37℃,培养16~24 h,挑取典型菌落2~3个接种于营养琼脂培养,37℃,培养16~24 h后,备用。

2.2.2生化鉴定对分离出的病原菌接种于蔗糖、葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇等生化发酵管,置于37℃,培养24 h,观察。

2.3致病力试验将试验菌液浓度调整为1个麦氏单位,细菌浓度为3×108cl f/L菌液备用。

将1日龄的雏鸡进行分组,雏鸡处理见表1。

表1 致病力试验分组Table1Pathogenicity test group

对5组雏鸡连续观察48 h的,并每12 h记录一次雏鸡的发病和死亡情况。试验结束后将雏鸡全部处死,并无菌采取病料回收菌株。

2.41166S rRN A PCCRR检测方法的建立

2.4.1引物设计本次试验根据GenBank中公布的大肠杆菌16S rRN A通用引物,由上海杰李生物公司合成,其PCR产物为552 bp。

2.4.2病原菌的PCR扩增本试验采用单菌落PCR,试验采用采用25 μL体系,见表2。

表2 PCR反应体系Table2PCR reaction system

反应程序为:94℃预变性5 m i n,94℃变性45 s、56.1℃退火45 s、72℃延伸50 s,共35个循环,最后72℃延伸5 m i n。

反应结束后取10 μL PCR产物,于1%琼脂糖凝胶,以115 V、100 m A于1×TBE缓冲液中电泳45 m i n后,将琼脂糖凝胶置于凝胶成像系统成像、记录。

2.4.3克隆测序将回收的PCR产物按照琼脂糖凝胶回收试剂盒说明,对DN A回收后,送至上海杰李生物公司进行克隆测序。并在美国国家生物技术信息中心(N CBI)数据库,运用Bl ast软件进行比对。

3 试验结果

3.1解剖结果病死鸡关节肿胀变形,皮肤及大腿肌肉内可见散在出血点,肝脏明显肿大,心包膜增厚,小肠黏膜充血,可见散在出血点。

3.2病原菌分离培养结果病料接种于营养琼脂上,可见圆形、半透明、表面湿润的单个菌落;麦康凯培养基上可见光滑的粉红色菌落;伊红美兰培养基上有黑色有金属光泽的圆形菌落。挑取典型菌落经革兰氏染色后,可见革兰氏阴性的短杆菌两端钝圆,大多数散开排列少数有2个连在一起,与相关的文献描述一致[6],如图1所示。

图1 病原菌革兰氏染色结果Fig.1Gram stain results of pathogenic bacteria

3.3生化鉴定结果生化鉴定试验结果如表3所示。

表3 生化鉴定结果Table3Results of biochemical identification

从表3可以看出,菌株DZM G与菌株DZK的生化特性一致,而且菌株DGCG1和DCGP3的生化特性与菌株DZK的生化特性基本相同,所以初步判定DZM G、 DGCG1、DGCP3这3株菌株符合大肠杆菌的生化特性。

3.4致病力试验结果分离到的3株菌株(DZM G、DGCG1、DGCP3)进行致病力试验的结果如表4所示。

表4 致病力试验雏鸡死亡情况记录表Table4Mortality of chickens in pathogenicity test

从表4可以看出本次试验所用的3株菌株均存在致病性,而且DZM G致病力最强,死亡率100%;DGCP3的致病力次之,死亡率75%;DGCG1的死亡率只有50%。

3.5试验菌株1166S rRRNN AA检测结果将PCR产物,通过凝胶成像系统观察的结果如图2所示。

图2 试验菌株16S rRNA PCR结果Fig.2Results of 16S rRNA PCR test

从图2可以看出,试验菌DZM G、DGCG1、DGCP3均得到552 bp的特异性条带,而对照菌J ZK、SZK、KZK均未得到相应条带。

3.6测序结果经过克隆测序后发现试验菌株的16S rRN A基因序列与鸡致病性大肠杆菌16S rRN A序列同源性为100%。

4 讨论与分析

本次试验通过对病原菌分离培养、生化试验和致病力试验,结果表明,3株试验菌株(DZM G、DGCG1、DGCP3)均为致病性大肠杆菌。同时,对3株菌株进行分子生物学鉴定,所得到的16S rRN A序列通过在N CBI数据库中运用BLAST程序进行比对,结果发现3个试验菌株与大肠杆菌的同源性达到100%,根据M at suki的研究,凡是16S rRN A序列的同源性大于97%便可认为是同一种[7],说明16S rRN A对菌株的鉴定结果与分离培养生化鉴定的结果是一致的。但是,传统的分离鉴定试验存在试验周期长、工作量大而繁杂、准确性差等问题,而16S rRN A PCR鉴定方法则周期短、成本低、准确性高等优势。

图3 试验菌株16S rRNA同源性比对结果Fig.3Homology comparison results of test strains16S rRNA

近几年,PCR技术在实验室检测技术中发展快速,在医学检验方面有着十分突出成果[8]的技术,并广泛应用到了环境细菌学检验、临床细菌学检验、流行病学调查等领域。随着集约化养鸡业发展迅速,鸡致病性大肠杆菌病是生产中常见细菌病,并在一定程度上危害养鸡业的健康发展,给养禽业发展造成严重的经济损失[9]。所以,建立一种该病快捷的检测方法,对鸡大肠杆菌病的快速诊断、预防、治疗和控制等方面都具有积极作用。

[1]栗艳.鸡致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性分析[J].畜禽业,2013,(10):12-13.

[2]陶勇.四川鸡源致病性大肠杆菌血清型鉴定及质粒DN A分析[D].雅安:四川农业大学,2001.

[3]李宏娟.鸡致病性大肠杆菌的耐药性监测及基因型研究[D].保定:河北农业大学,2008.

[4]杨苗,程安春,汪铭书,等.基于鸭疫里默氏杆菌16 SrRN A PCR检测方法的建立和应用[J].四川农业大学学报,2007,3:343-347.

[5]赵红庆.五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR检测研究[D].长春:中国人民解放军军事医学科学院,2007.

[6]师福山,赵德明.禽大肠杆菌的分离与16S rRN A的鉴定[J].中国畜牧兽医,2009,2:111-113.

[7]李永峰,任南琪,杨传平,等.16S rDN A测序快速鉴定废水生物处理系统目标细菌[J].哈尔滨工程大学学报,2005,6:806-810.

[8]杨洋.PCR技术检测测乳品中金黄色葡萄球菌研究[D].保定:河北农业大学,2005.

[9]赵红庆.五种致腹泻大肠埃希菌的多重PCR检测研究[D].长春:中国人民解放军军事医学科学院,2007.

Establish a Identification Method of 16S rRNA PCR for Avian Pathogenic Escherichia Coli

Xu Rui1,J i Fang2,Li M engl ong1
(1.Departm ent of Ani m al Sci ence of Xi chang Col l ege,Xi changSi Chuan615013; 2.Feed m oni tori ng stati on of agri cul ture and Ani m al H usbandry Bureau of DeChang Country,DeChangSi Chuan 615500)

In order to establ i sh a rapi d i denti fi cati on m ethod of Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col i.The testcol l ected heart,l i ver,spl een,ki dney ofdi seases chi cken as di sease m ateri al, then through bacteri ali sol ati on and cul ture,bi ochem i cali denti fi cati on and pathogeni ci ty test. By usi ng com m on pri m ers of E.col i 16S rRN A,3 strai ns of test bacteri a w ere am pl i fi ed by PCR.And the speci fi c am pl i fi cati on products w ere obtai ned from 3 tested strai ns.The am pl i fi cati on products w ere sequenced and com pared w i th BLAST.The resul ts show ed that 3 strai ns of Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col i(DZM G,DGCG1,DGCP3)am pl i fi ed 16S rRN A gene sequence and Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col igene sequences of 100%anastom osi s.The m ethod to detect the Escheri chi a col i 16s rRN A PCR has good speci fi ci ty and si m pl e characteri sti cs.Betw een 3 strai ns pathogeni c Escheri chi a col i(DZM G,DGCG1,DGCP3)and Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col i,thei r hom ol ogy of16S rRN A gene sequences reached 100%.Thi s test w as suggested that the i denti fi cati on m ethod had the characteri sti cs of hi gh speci fi ci ty and si m pl e and rapi d.

Chi cken Pathogeni c Escheri chi a col i;Isol ati on and Cul ture;16S rRN A;PCR i denti ficati on m ethod

S852.61

B

1672-9692(2016)07-0001-05

2016-05-16

徐睿(1980-),女,四川西昌人,讲师,硕士,主要从事基础兽医教学及研究工作。

四川省凉山州农业科技创新项目(15NYCX0040);四川省科技厅支撑计划项目(13ZC1796)。

猜你喜欢

致病性雏鸡菌落
TTC应用于固体食品菌落总数测定研究
雏鸡的饲养管理技术要点
不同emm基因型化脓性链球菌的菌落形态
夏季严防雏鸡中暑
对比分析菌落总数检测片与国标法用于生鲜乳中菌落总数的检测
尿感方清除受感染膀胱上皮细胞胞内尿道致病性大肠杆菌的作用
食品微生物检验中菌落总数测定的注意事项
高致病性禽流感疫苗不同免疫方式对水禽的免疫效果观察
致病性大肠杆菌绿色荧光蛋白标记
雏鸡磺胺类药物中毒的诊治