白藜芦醇对冻融后小鼠成熟卵母细胞氧化应激水平和线粒体功能的影响

庄少虹　黄宝怡　曾艳婷　刘曼婷　徐佳慧　刘见桥广州医科大学附属第三医院广东省普通高校生殖与遗传重点实验室，广东广州　510150

白藜芦醇对冻融后小鼠成熟卵母细胞氧化应激水平和线粒体功能的影响

庄少虹黄宝怡曾艳婷刘曼婷徐佳慧刘见桥
广州医科大学附属第三医院广东省普通高校生殖与遗传重点实验室，广东广州510150

目的 探讨白藜芦醇（Res）对冻融后小鼠成熟卵母细胞活性氧（ROS）水平和线粒体功能的影响。方法 根据是否在冷冻复苏培养液中添加Res，将解冻后存活的卵母细胞分为两组：Res组和对照组。二氯荧光素二乙酸（DCFH-DA）检测ROS水平，JC-1荧光染色检测线粒体膜电位（ΔΨm）。结果 卵母细胞玻璃化冷冻解冻的存活率为89.0%（267/300），其中125、142枚分别进行ROS和ΔΨm检测。Res组的ROS水平 （0.64±0.17）较对照组（1.00±0.26）明显降低（P＜0.01），Res组的ΔΨm（1.16±0.40）较对照组（0.87±0.28）明显增加（P＜0.01）。结论 Res能降低小鼠冻融卵母细胞的氧化应激水平并增加其线粒体功能，可能有助于卵母细胞的损伤修复。

白藜芦醇；卵母细胞；玻璃化冷冻；活性氧；线粒体膜电位

近年来，人类卵母细胞的冷冻保存在辅助生殖领域中扮演着重要角色。特别是随着玻璃化冷冻技术的发展，卵子冷冻技术已经逐渐从“实验”阶段向“临床”使用阶段迈进。但由于卵母细胞是人体内最大的细胞，有其特殊的生物学特性，其相对于胚胎和精子更容易受到冷冻损伤。有研究指出，冷冻会造成卵母细胞内活性氧（reactive oxygen species，ROS）的增加[1]，已有证据表明，ROS的增加会进一步影响卵母细胞内的纺锤体等结构，并造成卵子受精失败和胚胎发育障碍[1-3]。另有学者报道，进行玻璃化冷冻的卵母细胞，其线粒体膜电位会显著降低[4-5]。白藜芦醇（resveratrol，Res）是近年研究热度仅次于紫杉醇的药物，具有抗肿瘤、抗氧化、延缓衰老等作用[6-8]，其对冷冻复苏的卵母细胞是否有保护作用仍罕有报道，因此，本研究通过在冻融卵母细胞的复苏培养液中添加Res，试图减轻冻融对卵母细胞造成的不良影响。

1　材料与方法

1.1材料与仪器

7～9周龄的SPF级雌性ICR小鼠（购自广东省实验动物中心）；孕马血清促性素（PMSG）（宁波第二激素厂）；绒促性素（HCG）（上海丽珠制药）；白藜芦醇（Sigma公司）；M2培养液（Sigma公司）；透明质酸酶（Vitrolife Sweden AB Goteborg，Sweden）；DEFH-DA（Sigma公司）；JC-1试剂盒（Sigma）；玻璃化冷冻解冻试剂盒（Kitazato Biophama Co.Ltd.Shizuoka.Japan）。冷冻试剂盒包括平衡液（ES）和冷冻液（VS），解冻试剂盒包括WS1、WS2、WS3及WS4。

仪器：共聚焦显微镜（Nikon-C2Si）。

1.2卵母细胞的收集

ICR雌鼠腹腔注射PMSG 10 U/只，46～48 h后注射HCG，10 U/只，13～15 h后处死，并立即于输卵管壶腹部收集卵丘-卵母细胞复合体，随后用10%透明质酸酶脱去颗粒细胞，得到成熟的MⅡ期卵母细胞。

1.3卵子冷冻解冻方法与实验分组

冷冻：将3～4枚卵母细胞置于20μL的ES液滴中，停留5 min，然后将卵子转移到另一个20μL的VS液滴中，停留约40 s后立即装载至开放式冷冻载体上，并迅速置于液氮中，从开始暴露于VS到置于液氮中的时间不超过1 min。解冻：从液氮中取出装有卵子的冷冻载体，迅速置于37℃预热的WS1液中，停留1 min，随后将卵母细胞依次转移至室温平衡过的WS2、WS3、WS4中，各停留3 min后判断卵母细胞是否存活。随后将那些透明带和细胞膜完整、胞质透亮的存活卵母细胞置于含或不含Res的M2培养液中继续培养3 h，即依据是否在冷冻复苏培养液中添加Res分为对照组和Res组。Res在培养液中的浓度为25μmol/L。

1.4ROS水平的检测

二氯荧光素二乙酸（DCFH-DA）是检测ROS的常用试剂，本身没有荧光，但其可以自由穿过细胞并被细胞内的ROS氧化生成DCFH，而生成的DCFH能发出荧光却不能透过细胞膜，因此，DCFH逐渐在细胞内积累并能被激光共聚焦显微镜观察到。荧光强度越强，说明细胞内的ROS水平越高。检测时，将对照组和Res组的卵母细胞同时置于预热过的10 mmol/L的工作液中，避光并在37℃、5%CO2培养箱中孵育20 min，洗涤3～5次后立即用激光共聚焦显微镜进行观察。

1.5线粒体膜电位（ΔΨm）的检测

JC-1是目前使用最广泛的ΔΨm检测荧光探针。当ΔΨm＜100 mV时，JC-1为单体形式，产生绿色荧光，但当ΔΨm＞140 mV时，JC-1聚集形成聚合物，产生红色荧光。因此，通过红绿荧光强度的相对比值便可准确地判断卵母细胞ΔΨm，其比值越高，表明卵母细胞ΔΨm越高，即线粒体的功能越活跃。检测时，将200×的JC-1浓储存液用超纯水及缓冲液稀释成1×的染色工作液，并配成微滴置于37℃培养箱预热。随后，将要检测的卵母细胞置于微滴中，37℃、5%CO2培养箱中孵育20 min。使用4℃预冷的缓冲液洗涤3～5次后，立即用激光共聚焦显微镜观察保存，并用Image J软件进行定量分析。

1.6统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件对数据进行分析和处理，计量资料以均数±标准差（）表示，采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1玻璃化解冻复苏存活率

共冷冻解冻300枚成熟的MⅡ卵母细胞，其中有267枚存活，总的存活率为89.0%，形态正常且存活卵母细胞被分配到对照组和Res组中，进行线粒体膜电位和ROS水平的检测。

2.2对照组和Res组ROS荧光图像及其相对荧光强度比较

共纳入125枚存活的MⅡ卵母细胞，对照组和Res组分别为63枚和62枚。从图1可以看出，对照组的绿色荧光相对较强，而Res组的荧光强度较对照组明显减弱；Res组和对照组的相对荧光强度分别为0.64±0.17和1.00±0.26，差异有高度统计学意义（P=0.000），说明在复苏培养中添加Res能显著降低冻融卵母细胞的ROS水平。

图1　对照组和Res组ROS荧光图像及其相对荧光强度比较

2.3对照组和Res组线粒体膜电位荧光图像及其红/绿荧光强度比值比较

共有142枚冻融后存活的卵母细胞进行该项检测，对照组和Res组分别为72枚和70枚。从图2可以看出，对照组和Res组的红色荧光均主要分布于卵母细胞的外周，绿色荧光分布于整个胞浆；Res组和对照组的红/绿荧光强度比值分别为 1.16±0.40和0.87±0.28，差异有高度统计学意义（P=0.000），说明在复苏培养液中添加Res后，冻融卵母细胞的ΔΨm明显增加。

图2　对照组和Res组线粒体膜电位荧光图像及其红/绿荧光强度比值比较

3　讨论

卵母细胞的冷冻保存作为女性生育力保存的重要方法，在辅助生殖领域中具有不可替代的作用。早在1986年，Chen等就使用人冷冻复苏卵子并首次获得成功妊娠，但其后20余年，该项技术发展缓慢，而近几年发展起来的玻璃化冷冻技术使卵母细胞冷冻的存活率相比过去的程序化冷冻大大增加，但其胚胎发育潜能仍明显比新鲜卵母细胞差[9-12]。胚胎学家们一直尝试各种方法，如改善冷冻方法和改良冷冻液配方来减少冷冻损伤，但其效果仍不理想[13]。Res是广泛存在于花生、紫葡萄、红酒、虎杖、桑椹等植物中的一种多酚类化合物，已有大量研究证实，其具有抗氧化、抗肿瘤、延缓衰老等作用[6-8]，本文首次尝试在小鼠冷冻复苏培养液中添加Res，发现其能减少冻融后卵母细胞ROS的生成，并增加线粒体的活力。

细胞氧化磷酸化过程中产生的过量ROS会导致氧化应激，即氧化和抗氧化失衡，其会产生一系列的病理过程并最终导致细胞老化和凋亡[14]。已有研究证实，冷冻会造成卵母细胞中ROS的异常增加[1]，而ROS的增加会损伤卵母细胞中的纺锤体和细胞骨架，并进一步对卵母细胞的正常受精和胚胎发育产生不利影响[1，3]。本研究证实，Res能显著减少冻融后卵母细胞中ROS的产生，这将提高卵母细胞的质量，并减少冻融卵母细胞的受精失败率和胚胎阻滞率。

线粒体作为胞质中最重要的细胞器，对卵母细胞成熟和胚胎发育具有重要的作用[15-16]。冷冻过程中因渗透压改变，剧烈的温度、pH变化、冰晶形成等因素造成的线粒体损伤会导致ΔΨm下降[4-5]，而ΔΨm是氧化磷酸化过程生成ATP能力的反映。也就是说，当卵母细胞的ΔΨm较低时，则说明其生成ATP的能力下降，卵母细胞的进一步受精和胚胎发育也将因为供能不足而受到影响[17-18]。本研究通过在冻融卵母细胞的复苏培养液中添加Res，明显增加了线粒体膜电位，提高了线粒体的活力，这将会增加卵母细胞ATP的产生，并促进其进一步受精和发育。

以往研究报道，Res的使用剂量因实验条件和实验对象的改变而有所不同[19-21]。Liu等[19]在卵母细胞的体外成熟过程中添加Res来对抗丙酮醛引起的氧化应激反应，研究探讨了5、10、25μmol/L三个作用浓度对卵母细胞ROS水平和线粒体分布等因素的影响，结果显示，随着Res作用浓度的增加，卵母细胞内的ROS水平逐渐下降，线粒体异常分布的比例也逐渐下降，即25μmol/L的Res能显著改善卵母细胞的ROS水平和线粒体分布。另外，有研究证实，在胚胎培养液中添加过高浓度的Res会降低胚胎的发育潜能[14]；Price等[22]发现，在小鼠C2C12细胞中，25μmol/L的Res会增加线粒体ΔΨm和ATP的产生，而50μmol/L的Res的作用则相反。具体原因仍不清楚，但可能与Res的溶解剂二甲基亚砜（DMSO）有关。Res不溶于水，必须使用DMSO等物质进行溶解，而DMSO本身对细胞和胚胎具有毒性作用[23-24]。因此，本研究选择25μmol/L的Res作为最终的作用浓度，结果显示，该浓度的Res能显著降低冻融后卵母细胞的ROS水平并增加线粒体的ΔΨm，但该浓度是否为最佳的使用浓度仍需进一步探讨。

Res减少卵母细胞 ROS产生和增加 ΔΨm的具体机制仍不清楚，有研究指出，这可能与其能活化Sirt1/AMPK和Nrf2通路有关[7]，但仍需进一步研究证实。总之，本研究表明，Res作为一种强的抗氧化剂，能有效降低小鼠冻融卵母细胞内的ROS水平并改善线粒体功能，对冷冻造成的卵母细胞损伤具有修复作用。

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Influence of resveratrol on oxidative stress level and m itochondrial function of vitrified-thawed mature oocytes in m ice

ZHUANG ShaohongHUANG Baoyi ZENG YantingLIU MantingXU Jiahui LIU Jianqiao
Key Laboratory of Reproduction and Genetics of Guangdong Higher Education Institutes,the Third Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangdong Province,Guangzhou510150,China

Objective To explore influence of resveratrol(Res)on reactive oxygen species(ROS)level and mitochondrial function of vitrified-thawed mature oocytes in mice.M ethods According to whether add Res to the post-warming culture medium or not,survived oocytes after thawing were divided into two groups:Res group and control group.The level of ROS was measured by DCFH-DA,while the mitochondrial membrane potential(ΔΨm)was detected by JC-1 fluorescence staining.Results The survive rate of oocytes vitrification was 89.0%(267/300),and 125 of the survive oocytes were detected by ROS while 142 of them were detected byΔΨm.ROS level in Res group(0.64±0.17)was significantly lower than that in control group(1.00±0.26)(P＜0.01).ΔΨm of Res group(1.16±0.40)was significantly higher than that of control group(0.87±0.28)(P＜0.01).Conclusion Res reduces oxidative stress level and improves mitochondrial function of vitrified-thawed mature oocytes in mice.It may contribute to the repair of cryodamage in vitrified-thawed oocytes.

Resveratrol;Oocyte;Vitrification;Reactive oxygen species;Mitochondrial membrane potential

R-332

A

1673-7210（2016）04（b）-0027-04

庄少虹（1989.4-），女，广州医科大学妇产科专业2013级在读硕士研究生；研究方向：生殖内分泌。

刘见桥（1970.5-），男，博士，主任医师，广州医科大学附属第三医院生殖中心主任；研究方向：生殖内分泌。

（2016-01-03本文编辑：李亚聪）