白术内酯Ⅱ抗血小板作用及对血小板中蛋白激酶B磷酸化水平的影响

陈一竹　杨文龙　郭玲玉　张明亮　刘俊岭　张俊峰.上海交通大学医学院附属第九人民医院心内科，上海　0900；.上海交通大学医学院基础医学院，上海　0005

白术内酯Ⅱ抗血小板作用及对血小板中蛋白激酶B磷酸化水平的影响

陈一竹1杨文龙1郭玲玉1张明亮1刘俊岭2张俊峰1
1.上海交通大学医学院附属第九人民医院心内科，上海201900；2.上海交通大学医学院基础医学院，上海200025

目的 观察白术内酯Ⅱ在体外对小鼠和人血小板活化的影响，并探讨其可能的分子机制。方法 通过体外血小板聚集实验，采用比浊法测定不同浓度白术内酯Ⅱ对胶原诱发的小鼠及人血小板聚集的影响；通过血小板的铺展实验，检测白术内酯Ⅱ对人血小板铺展的作用；运用Western blot检测人血小板中蛋白激酶B（Akt473）的磷酸化水平。结果 白术内酯Ⅱ可抑制胶原刺激下小鼠和人血小板的体外聚集（P<0.01）；经白术内酯Ⅱ处理后的人血小板铺展面积缩小（P<0.01）；人血小板中Akt473分子的磷酸化水平降低（P<0.01）。结论 白术内酯Ⅱ对胶原诱导的小鼠和人血小板聚集能产生显著抑制作用，对人血小板的铺展也有抑制作用，其作用机制可能与血小板活化过程中的PI3K-Akt信号通路有关，提示白术内酯Ⅱ是一种有效的抗血小板化合物。

白术内酯Ⅱ；血小板；血栓；蛋白激酶B

动脉血栓形成是缺血性心、脑血管疾病和其他血栓栓塞性疾病发病的关键环节，血小板聚集是动脉血栓形成的重要诱因。能否有效控制病理状态下血小板的活化、聚集是防治血栓性疾病的关键，临床上抗血小板药物的使用目前是心脑血管疾病防治的重要手段，在心脑血管疾病的一级及二级预防中广泛应用。因此，对抗血小板治疗药物的探索一直是预防血栓及心血管疾病基础与临床研究的热点。对我国中医药的研究中发现,许多具有活血化瘀作用的中药都含有抑制血小板聚集的有效组分。天然中草药与目前已上市的西药和生物技术产品相比，具有安全性好，口服有效且来源广泛等优点[1-3]。因此，发展纯天然的抗血栓药物是目前研制新型抗血栓药物的有效途径。白术内酯Ⅱ属倍半萜类内酯化合物，是常用中药白术的主要化学成分之一。有研究发现白术内酯Ⅱ能阻滞黑色素瘤细胞的细胞周期及诱导细胞凋亡，但其对血小板的作用目前尚不清楚[4-5]。本实验拟观察白术内酯Ⅱ对血小板活性是否有抑制作用，并探讨其可能的分子机制。

1　材料与方法

1.1试剂与仪器

健康人单采血小板由上海瑞金医院提供。胶原购自CHRONO-PAR（美国），蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂购自瑞士的罗氏公司，三磷酸腺苷双磷酸酶（apyrase）、前列腺素E（PGE1）、纤维蛋白原（Fg）购自西格玛公司（美国），磷酸化蛋白类激酶B（Akt473）抗体、GAPDH抗体购自Cell Signaling公司，鬼笔环肽购自美国生命技术公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔和山羊抗鼠IgG购自Jackson公司，Western发光液为Milipore公司生产，白术内酯Ⅱ购自上海纯优生物科技有限公司。血小板聚集仪 （CHRONO-LOG，美国），正置荧光显微镜（Zeiss公司，德国），电泳仪（上海天能科技有限公司，上海）。

1.2实验动物

C57BL/6野生型小鼠，6～8周，雌雄各半，体重（20±2）g，动物合格证号：2015000510330。动物饲养在上海交通大学医学院SPF级动物房，实验开始前1周进行适应性饲养，温度（23±1）℃，湿度（50±5）%，饲料和水均在消毒后由动物自由摄取。

1.3方法

1.3.1小鼠血小板聚集1%异戊巴比妥（0.2 m L/只）麻醉小鼠后，用加有抗凝剂枸橼酸钠的2.5 mL注射器抽取小鼠的腹主动脉血至15 mL BD管中，加入等体积的0.9%生理盐水，apyrase（终浓度1 U/mL）以及PGE1（终浓度为0.1μg/mL），颠倒混匀后室温离心，1050 r/min，10 min，吸取上层富含血小板血浆（PRP）至新的15 m L BD管中，加入apyrase（同上）和乙二胺四乙酸（EDTA，终浓度为5 mmol/L），颠倒混匀后室温离心，2100 r/min，10 min，弃上清，得到血小板，重悬于事先37℃预热好的台式缓冲液中，用全血细胞计数仪计数并将血小板稀释为3×108个/mL，37℃水浴静置1 h待用[6]。以二甲基亚砜（DMSO）作为溶剂，配制白术内酯Ⅱ溶液。白术内酯Ⅱ（终浓度为10μmol/L）与小鼠洗涤血小板（每管300μL）孵育3 min后，使用血小板聚集仪检测在胶原诱导下白术内酯Ⅱ对小鼠血小板聚集程度的影响。

1.3.2人血小板聚集 在富含人血小板血浆（PRP）中加入apyrase（终浓度2 U/mL）和EDTA（终浓度为5 mmol/L），室温离心，1900 r/min 10 min，得到血小板，重悬于台式缓冲液中，用全血细胞计数仪计数并稀释为3× 108个/mL，37℃水浴静置1 h。不同浓度的白术内酯Ⅱ与洗涤人血小板（每管300μL）孵育3 min，使用血小板聚集仪检测在胶原诱导下白术内酯Ⅱ对人血小板聚集程度的影响[7]。

1.3.3血小板在纤维蛋白原上的铺展将制备好的洗涤人血小板稀释为3×107个/m L，取100μL加到已铺有纤维蛋白原的玻璃爬片上，置于37℃恒温箱中孵育1 h；洗去爬片上未与纤维蛋白原结合的血小板，每个爬片上加100μL鬼笔环肽染料，室温避光孵育30 min；封片；使用正置显微镜的油镜观察并拍照，用NIH Image J软件计算铺展血小板的面积[8]。

1.3.4Ak t 473分子的磷酸化水平检测人血小板样品用2×SDS裂解液裂解并煮沸，用10%的聚丙烯酰氨凝胶电泳分离，并转到聚乙二烯氟化物膜上，以磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）作为相同上样量[9]。

1.4统计学方法

采用Graphpad prism 5软件分析和作图，正态分布的计量资料以均数±标准差（）表示，两组间比较采用t检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2　结果

2.1白术内酯Ⅱ对小鼠血小板聚集的影响

在胶原（1.3μg/mL）的刺激下，白术内酯Ⅱ为10μmol/L时就能显著的抑制小鼠血小板的聚集，与DMSO组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。见图1。

图1　白术内酯Ⅱ在刺激剂胶原的诱导下对小鼠血小板聚集的影响（n=4）

2.2白术内酯Ⅱ对人血小板聚集的影响

结果显示：白术内酯Ⅱ为10μmol/L时能明显抑制在胶原刺激下小鼠血小板的聚集，因此检测相同浓度的白术内酯Ⅱ对人血小板聚集的影响，在胶原（0.67μg/mL）的刺激下，白术内酯Ⅱ为10μmol/L时也能显著的抑制人血小板的聚集，且随浓度降低其抑制程度，与DMSO组比较，差异有高度统计学意义（P＜0.01），在白术内酯Ⅱ浓度为0.5μmol/L时基本无抑制作用。见图2。

图2　白术内酯Ⅱ在刺激剂胶原的诱导下对人血小板聚集的影响（n=4）

2.3白术内酯Ⅱ对人血小板铺展的影响

在固态纤维蛋白原上的铺展，经过不同浓度（1、5、10μmol/L）的白术内酯Ⅱ的处理后，血小板在纤维蛋白原上铺展的平均面积分别为（3847.3±1738.7）、（1926.2±786.1）、（1467.2±591.5）像素，而DMSO组铺展的平均面积为（8697.1±1388.9）像素，由此说明白术内酯Ⅱ能抑制血小板在纤维蛋白原上铺展。见图3。

2.4白术内酯Ⅱ对分子Akt473磷酸化的影响

PI3K/Akt是参与调节血小板活化的经典信号通路，因此，本研究探讨胶原（0.67μg/mL）刺激下白术内酯Ⅱ对血小板中Akt473分子磷酸化水平的影响。结果显示：白术内酯Ⅱ降低了人血小板中Akt473分子的磷酸化水平，并呈浓度依赖。见图4。

3　讨论

白术为菊科植物白术的干燥根，其性味甘、苦、温，具有健脾益气、燥湿利水、止汗、安胎的功效，可用于脾虚食少、腹胀腹泻、痰饮眩悸、水肿、自汗、胎动不安等，是临床上常用的中药[10-11]。白术中主要含有挥发油和内酯类化合物，白术内酯Ⅱ是白术内酯类成分之一，具有抗炎抗肿瘤作用，具有调节胃肠道功能和促进营养物质吸收的功效[12-13]。有资料显示白术有抗栓作用[14-15]，但其具体机制是通过影响血小板还是凝血系统以及有效成分为何目前尚无报道[11]。

图3　白术内酯Ⅱ对人血小板铺展的影响（n=4）

图4　Western blot检测经不同浓度白术内酯Ⅱ处理后人血小板中Akt473分子磷酸化的水平

冠状动脉疾病等血栓栓塞性疾病的发病率逐年增加，而血栓形成是一个复杂的病理过程，血小板激活在血栓形成过程中发挥着至关重要的作用，因此抗血小板聚集在防治血栓栓塞性疾病中具有重要意义[16]。胶原是常用血小板聚集的刺激剂[17-18]，本研究显示白术内酯Ⅱ以较低浓度抑制了小鼠血小板在胶原刺激下的体外聚集，对人血小板也具有较强的抑制作用，且具有浓度梯度。血小板的铺展是由整合素介导的。血小板接收到其表面受体传递到细胞内部的活化信号后，通过一系列的下游蛋白激活和抑制将信号传递到整合素，从而使整合素活化，即为血小板的内向外信号传递，活化的整合素与纤维蛋白原特异性结合，从而向胞内传递外向内信号引起血小板活化信号的进一步放大。整合素所介导的双向信号在血小板聚集、铺展和稳定血栓形成中起着至关重要的作用[19-20]。白术内酯Ⅱ可能通过影响整合素的外向内信号从而抑制血小板的铺展。

在血小板的活化过程中有多种信号分子的参与，已有研究证实分子Akt在血小板黏附、聚集、铺展的过程中具有重要作用[21]。在白术内酯Ⅱ抗炎的相关研究中也发现其对PI3K-Akt信号通路有影响[22]。因此本研究检测了在胶原的刺激下，经过白术内酯Ⅱ处理后人血小板蛋白中Akt473分子的磷酸化水平变化[16-17]。结果显示，白术内酯Ⅱ处理后，人血小板中Akt473分子的磷酸化水平明显降低，提示白术内酯Ⅱ可能通过抑制PI3K-Akt通路，进而抑制血小板的活化。

综上所述，本研究结果表明，白术内酯Ⅱ能有效抑制胶原诱导的血小板聚集，并通过影响PI3K-Akt通路来抑制血小板的活化，为白术内酯Ⅱ成为新型抗血栓药物提供了可能。

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Influence of atractylenolideⅡ on p latelet and phosphorylation level of protein kinase B

CHEN Yizhu1YANG Wenlong1GUO Lingyu1ZHANG Mingliang1LIU Junling2ZHANG Junfeng1
1.Department of Cardiology,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine, Shanghai201900,China;2.School of Basic Medicine,Shanghai Jiao Tong University School of Medicine,Shanghai 200025,China

Objective To observe the effects of the atractylenolideⅡon mice and human platelet in vitro and discuss the underlying mechanism.M ethods The effect of atractylenolideⅡ on mice and human platelet aggregation was induced by collagen in vitro.The effect of atractylenolideⅡ on human platelet was detected through the experiment of spreading.The phosphorylation level of Akt473 was detected by Western blot.Results AtractylenolideⅡinhibited collagen-induced mice and human platelet aggregation(P<0.01),and the spreading of human platelets on immobilized fibrinogen treaded with atractylenolideⅡwas diminished(P<0.01).The level of phospho-Akt 473 was downregulated in the presence of atractylenolideⅡ(P<0.01).Conclusion These results show that atractylenolideⅡ affected the platelet aggregation and spreading,and through regulating the PI3K-Akt signal way to inhibit platelet activities,atractylenolideⅡis an effective antiplatelet compounds.

AtractylenolideⅡ;Platelet;Thrombus;Akt473

R285.5

A

1673-7210（2016）04（b）-0018-05

上海交通大学医学院附属第三人民医院自然科学研究基金资助项目（syz2015-002）。

陈一竹（1988-），女，上海交通大学2013级内科学专业在读硕士研究生；研究方向：冠心病。

张俊峰（1972-），男，教授，硕士研究生导师；研究方向：冠心病。

（2016-01-11本文编辑：苏畅）