白细胞介素-6受体基因启动子区-183A/G和外显子9Asp358Ala多态性与肥胖的相关性

张 明 王春萍 刘一帆 张 涛 马芙蓉 田林红 何丽蓉

(兰州大学第二医院内分泌代谢科，甘肃 兰州 730030)



白细胞介素-6受体基因启动子区-183A/G和外显子9Asp358Ala多态性与肥胖的相关性

张 明 王春萍1刘一帆 张 涛 马芙蓉 田林红 何丽蓉

(兰州大学第二医院内分泌代谢科，甘肃 兰州 730030)

目的 探讨白细胞介素(IL)-6受体基因启动子-183A/G(rs4845617)和外显子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)多态性与肥胖的相关性。方法 肥胖组268例，对照组219例，以聚合酶链反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)法分析IL-6受体基因型，并进行临床生化检测。结果 对照组Asp358Ala的三种基因型频率和等位基因频率分别为AA 28%、AC 45%、CC 27%、A 52%、C 48%，肥胖组相应为43%、46%、11%、66%、34%，肥胖组AA基因型频率和A等位基因频率高于对照组(P<0.01)。-183A/G三种基因型频率和等位基因频率两组差异无统计学意义(P>0.05)。携带A等位基因的患者发生肥胖的风险是C等位基因的1.809倍(P<0.01)。结论 IL-6受体基因Asp358Ala多态性可能与中国人肥胖相关。

白细胞介素6受体；基因多态性；肥胖

脂肪能分泌数十种脂肪细胞因子、激素或其他调节物，在机体代谢及内环境稳定中发挥重要作用。白细胞介素(IL)-6是一种重要的炎性调节因子，具有多种重要的生理功能，参与糖代谢和脂代谢。而IL-6的生物学作用是通过与白细胞介素6受体(IL-6R)相结合来完成的。对IL-6R基因的扫描发现，在启动子区-183A/G(rs4845617)和外显子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)存在单核苷酸多态性(SNP)。SNP是一种不基于假设的无偏倚的分析方法，因而有最大可能找出疾病的易感基因〔1，2〕。近年来，在不同人种中关于IL-6R基因多态性与糖尿病、肥胖、代谢综合征(MS)之间的研究结论不一，甚至相互矛盾。本研究探讨IL-6R基因启动子区-183A/G(rs4845617)和外显子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)多态性与肥胖的相关性。

1 对象与方法

1.1 研究对象 肥胖组268例，男142例，女126例，平均年龄(66.2±4.2)岁，彼此之间无亲缘关系，来自2005年6月至2013年9月门诊和住院的患者，均符合WHO的肥胖诊断标准；对照组219例，男110例，女109例，平均年龄(64.8±3.1)岁，为同期我院进行健康体检者；以上人群彼此无亲缘关系且排除2型糖尿病、糖耐量异常、空腹血糖受损或糖耐量异常合并空腹血糖受损者，无2型糖尿病家族史，无冠心病、高血压、肾病等。

1.2 方法

1.2.1 临床资料 均测量血压，脱鞋及穿内衣于相同条件下测身高及体重，计算体重指数(BMI)，平脐测腰围(WC)。空腹10 h后于清晨抽取静脉血，测定空腹血糖(FBG)、甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)，空腹胰岛素(FINS)采用放免法测定(北京原子高科核技术应用股份有限公司，批内CV<10%，批间CV<15%)。对照组与肥胖组在性别构成比、年龄、收缩压〔SBP，(122.7±16.5) vs (124.4±13.1)mmHg〕、舒张压〔DBP，(78.4±9.5) vs (79.6±12.2)mmHg〕、FPG〔(4.5±0.5) vs (4.6±0.6)mmol/L〕、TC〔(4.10±0.85) vs (4.65±1.05)mmol/L〕无统计学意义。而肥胖组的WC、BMI、TG、LDL-C、FINS均高于对照组(P<0.05或P<0.01)，HDL-C低于对照组(P<0.05)。见表1。

表1 两组一般临床资料±s)

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01，下表同

1.2.2 试剂 DNA抽提试剂盒、TaqDNA聚合酶、dNTPs、Marker、引物、限制性内切酶BcnⅠ和HinfⅠ，以上试剂均购自北京博大泰克公司。

1.2.3 IL-6R基因启动子和外显子多态性的检测 ①分离外周血白细胞，经细胞裂解液裂解，严格按照说明书提取外周血基因组DNA，-20℃备用。②目的基因的扩增：启动子-183(A/G)上游引物：5′CGCAGGAGCCCGGCTCTCTACACA3′，下游引物：5′CCATCCGCTCCGGCTTTCGTAACC3′；外显子9 Asp358Ala上游引物：5′CAGAGGAGCGTTCCGAAGG3′，下游引物：5′GTTAAGCTTGTCAAATGGCCTGTT3′。反应体系25 μl，包含10 ng(1 μl)基因组DNA，10×PCR缓冲液2.5 μl，10 mmol/L dNTP0.5 μl，0.5 μmol/L引物各1 μl，5 U/μl TaqDNA酶0.2 μl，用18.8 μl双蒸水补足反应体系。反应条件：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸45 s，共35个循环。72℃终末循环8 min，置4℃终止反应(PCR反应仪：美国ABI公司GeneAMP2700)。③鉴定基因型：取PCR产物经电泳鉴定后，各取10 μl，分别以限制性内切酶BcnⅠ、HinfⅠ在37℃酶解过夜。2%琼脂糖于80 V电压电泳10 min，溴乙啶染色后在紫外灯下观察基因型。

1.3 统计学方法 应用SPSS19.0统计软件，组间比较进行t和χ2检验。

2 结 果

2.1 IL-6R基因-183(G/A)和Asp358Ala多态性位点等位基因和基因型频率分布 PCR酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳后，在紫外灯下可看到：在启动子-183(A/G)多态性检测时，AA纯合子为208 bp和11 bp两条带；GG纯合子为143 bp、65 bp、11 bp三条带；AG杂合子为208 bp、143 bp、65 bp、11 bp四条带；在外显子9Asp358Ala多态性检测时，AA纯合子为188 bp和70 bp两条带；CC纯合子不能被切开，只有258 bp一条带；AC杂合子为258 bp、188 bp、70 bp三条带。启动子区-183G/A(rs4845617)和外显子9Asp358Ala(rs8192284 A/C)的基因型和等位基因频率分布在对照中均符合Hardy-Weinberg平衡(P值分别为0.35和0.12)。-183(G/A)基因型频率和等位基因频率在肥胖组和对照组中差异无统计学意义(P>0.05)。而Asp358Ala的基因型频率和等位基因频率在肥胖组中AA基因型明显多于对照组(P<0.01)。等位基因分布分析提示，A等位基因频率在肥胖组中多见(P<0.01)。在等位基因频率的比较中，OR值为1.809 (95%CI1.397 ～2.344)，即携带有A等位基因发生肥胖的风险是C的1.809倍。见表2。

表2 两组IL-6R基因Asp358Ala和-183(G-A)基因型和等位基因频率比较〔n(%)〕

2.2 IL-6R基因Asp358Ala各基因型与WC和BMI的相关性 Asp358Ala不同基因型(AA、AC、CC)间比较，WC〔(92.3±9.8)，(87.9±8.9)和(85.8±9.4)cm，P<0.01〕和BMI〔(30.5±5.3)，(28.5±4.7)和(26.1±3.8)kg/m2，P<0.01〕差异有统计学意义。外显子9的Asp358等位基因纯合子的WC和BMI高于其他基因型携带者。

3 讨 论

IL-6是多功能细胞因子，通过对多种靶细胞的作用，对细胞的生长、分化及某些基因的表达发挥调节和诱导作用，参与糖代谢和脂代谢〔3〕。IL-6与肥胖的关系非常密切，IL-6R基因位于染色体1q21.3，-183G/A(rs4845617)是位于IL6R基因启动子区的变异，该位点是核因子(NF)-1的结合位点，NF-1对IL-6R基因有激活和阻遏作用，从而影响IL-6R基因的转录和表达〔4〕，推测可能会影响糖代谢和脂代谢。但在本研究中-183G/A(rs4845617)的多态性和肥胖无关，说明-183A/G变异在甘肃汉族人群中对肥胖无影响。Asp358Ala(rs8192284 A/C)是位于外显子9的A/C多态性，可引起错义突变，引起Asp358Ala的氨基酸替代。

近年来国内外对IL-6R基因多态性与肥胖、2型糖尿病、MS的关系的研究结论不一。有研究显示，在Pima印第安人〔5〕中启动子区-183G/A(rs4845617)和外显子9 Asp358Ala(rs8192284 A/C)的多态性与肥胖相关，但在美国白人〔6〕和丹麦白人〔7〕中外显子9的A/C多态性与肥胖无关而与2型糖尿病相关。这说明该位点多态性的影响在不同种族存在差异。即使在中国汉族人群中的研究，结论也不一致，闫彩凤等〔8〕认为rs4845617和rs8192284多态性在北京人群中与BMI和WC相关，而Jiang等〔9〕在广州人群中提示该多态性与肥胖不相关而与血糖和MS相关。本课题组既往在甘肃汉族人群中的研究发现〔10,11〕，IL-6R基因Asp358Ala与2型糖尿病和MS相关。本研究为避免糖代谢异常对IL-6R基因多态性基因型分布和等位基因频率的影响，在样本的选择上剔除了2型糖尿病、糖耐量异常、空腹血糖受损以及糖耐量异常合并空腹血糖受损的患者。 本文结果发现，rs8192284的多态性与甘肃汉族人中的肥胖有相关性，Asp等位基因携带者与Ala等位基因携带者比较，肥胖的易感性增加，说明Asp358纯合子发生肥胖的危险性较高。

IL-6R基因Asp358Ala导致肥胖易感性增加的可能机制是基因变异影响了可溶性白细胞介素6受体(sIL-6R)水平，但是sIL-6R的减少通过哪些机制来增加肥胖的易感性，目前仍不太清楚。

总之，甘肃人群中发现IL6R基因外显子9Asp358Ala和启动子-183(A→G)存在多态性，而且外显子9Asp358Ala多态性与肥胖易感性有关联。但肥胖是一种多基因及环境因素联合作用的病因复杂疾病。对于大多数的肥胖来说，是否存在一个或几个主效基因目前尚未肯定，还需要更大样本的深入研究。

1 贾伟平.对代谢综合征的探索和研究在继续〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2010；26(9)：737-9.

2 朱啸光，宁 光.2型糖尿病的全基因组关联研究〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2010；26(12)：1094-6.

3 Kershaw E，Flier J.Adipose tissue as an endocrine organ〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2004;89(6)：2548-56.

4 Gronostajski R.Roles of the NFI/CTF gene family in transcription and development〔J〕.Gene,2000;249(2)：31-45.

5 Wolford JK，Colligan PB，Gruber JD，etal.Variants in the interleukin 6 receptor gene are associated with obesity in Pima Indians〔J〕.Mol Genet Metab，2003;80(3)：338-43.

6 Wang H，Zhang Z，Chu W，etal.Molecular screening and association analyses of the interleukin 6 receptor gene variants with type 2 diabetes，diabetic nephropathy and insulin sensitivity〔J〕.J Clin Endocrinol Metab，2005;90(2)：1123-9.

7 Hamid YH，Urhammer SA，Jensen DP，etal.Variation in the interleukin-6 receptor gene associates with type 2 diabetes in Danish whites〔J〕.Diabetes，2004;53(12)：3342-5.

8 闫彩凤，向红丁，陈 伟，等.白细胞介素6受体基因多态性与肥胖的关联研究〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2010;26(2)：125-6.

9 Jiang QJ，Lam TH，Liu B，etal.Interleukin-6 receptor gene polymorphism modulates interleukin 6 levels and the metabolic syndrome：GBCS-CVD〔J〕.Obesity，2010;18(10)：1969-74.

10 张 明，田林红.白细胞介素6受体基因单核苷酸多态性与2型糖尿病的关联性〔J〕.中华医学遗传学杂志，2006;23(6)：662-4.

11 张 明，陈 慧，张 涛，等.白细胞介素6受体基因多态性与代谢综合征的相关性研究〔J〕.中华内分泌代谢杂志，2012;28(7)：572-4.

〔2015-05-11修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

甘肃省自然科学基金(No.1506KJZA239);兰州市科技计划项目(2011-2-61)；甘肃省科技支撑计划-社会发展计划项目(No.0708NKCA099)

王春萍(1972-)，女，副主任医师，主要从事小儿内分泌基础与临床研究。

张 明(1970-)，男，硕士，副主任医师，主要从事内分泌代谢病基础与临床研究。

R589

A

1005-9202(2016)20-5021-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.036

1 兰州市妇幼保健院儿科