异甘草素对人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞株SKOV3体外增殖的抑制和诱导自噬作用

王 颖 洪铭岩 周秀敏

(唐山市工人医院妇产科，河北 唐山 063000)



异甘草素对人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞株SKOV3体外增殖的抑制和诱导自噬作用

王 颖 洪铭岩1周秀敏

(唐山市工人医院妇产科，河北 唐山 063000)

目的 探讨异甘草素(ISL)对人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞株SKOV3体外增殖的抑制作用。方法 从30例卵巢浆液性乳头状腺癌患者中提取SKOV3细胞株，采用MTT比色法观察分析ISL对SKOV3细胞株体外增殖的抑制作用；应用Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达水平。结果 ISL能够有效抑制SKOV3细胞株的体外增殖，与药物使用时间、剂量呈正比；ISL对SKOV3细胞株作用48 h后，ISL剂量5、10 μg/ml的两组细胞自噬相关蛋白表达明显高于对照组(P<0.05)。细胞核进行荧光染色后，出现变圆、破碎以及染色质浓缩的现象。结论 ISL对人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞株SKOV3体外增殖有明显的抑制与诱导肿瘤细胞自噬的作用，是一种有效的治疗检测方法。

异甘草素；卵巢浆液性乳头状腺癌；SKOV3细胞株

异甘草素(ISL)是一种黄酮类化合物，是甘草中一种非常重要的活性成分，能够起到抗肿瘤、抗病毒以及抑制脂质过氧化等作用。ISL对多种肿瘤细胞都有明显的体外抑制作用〔1〕，本文重点分析ISL对人卵巢浆液性乳头状腺癌细胞株SKOV3体外增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 本研究经唐山市工人医院伦理委员会批准，受试患者均签署知情同意书。SKOV3细胞株从临床30例卵巢浆液性乳头状腺癌患者身上提取。ISL由天津马克生物技术有限公司生产(批号为GC 2012203)；胎牛血清由杭州四季青公司生产；DMSO、MTT从Sigma实验所购买，兔抗人Beclin1抗体和兔抗人LC3抗体均购自美国Santa Cruz公司。

1.2 检测方法 将含量10%的胎牛血清、100 U/ml的青霉素、100 μg/ml链霉素培养液在37℃、含量5%的二氧化碳饱和湿度培养箱中培养，选取对数生长期的细胞用于研究。采用MTT法检测细胞的生长情况。选取对数生长期的SKOV3细胞，将其加入到96孔板中，采用1×10个/孔方式，等待细胞过夜并且贴到孔板壁上时，试验组加入不同的浓度的ISL，浓度分别是5、10 μg/ml，对照组加入等体积的DMEM培养液。每组设5个复孔，37℃、5%的二氧化碳饱和湿度条件下培养6、12、24、48 h后，再在每个孔中加入浓度为5 mg/ml的20 μl MTT，继续培养4 h，丢掉上层液，再在每个孔中加入150 μl的DMSO，然后振荡3 min，溶解结晶，490 nm处用酶标仪检测其吸光度A值，细胞抑制率=(1-试验组A值/空白对照组A值)×100%，重复三次，取三次的平均值。观察ISL不同浓度下作用48 h后的SKOV3细胞形态学变化，采用荧光染色法观察细胞形态学变化并且拍照。吖啶橙/溴乙啶双荧光染色后观察细胞形态。取对数生长期的SKOV3细胞，以1×105个/孔接种于6孔板，24 h细胞贴壁后换液，加入不同浓度的ISL，使其终浓度为0、5、10 μg/ml，继续培养48 h，弃上清液，PBS清洗3遍，RIPA裂解液冰上裂解细胞提取蛋白，蛋白质定量试剂盒BCA法蛋白定量、变性，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。转膜成功后，50 g/L脱脂奶封闭2 h，分别加入一抗GAPDH、Beclin1、LC3(1∶1 000稀释)，4℃条件下孵育过夜，洗膜，二抗孵育1 h，洗膜，滴加ECL超敏化学发光剂，暗盒曝光显影，采用Image J软件进行定量分析。

1.3 统计学分析 采用SPSS17.0软件行t检验。

2 结 果

2.1 ISL对人SKOV3细胞株体外增殖的抑制作用 5、10 μg/ml的ISL对人SKOV3细胞株体外增殖有明显的抑制作用，并且随着药物浓度的增加与培养时间增加，抑制作用更加明显，抑制作用明显好于对照组(P<0.05)，见表1。

2.2 形态学观察 试验组采用不同浓度的ISL作用6、12、24、48 h后，光镜下细胞出现皱缩变圆、体积也随之缩小；细胞质中能够看到比较多的颗粒与空泡，胞核不清晰，有片状无细胞生长区。对照组的细胞贴壁生长、几乎没有脱落的，细胞形态比较完整，细胞质比较饱满清晰，邻近的细胞能够生长并融合成片状，能够看到核分裂现象，见图1。

表1 ISL对人SKOV3细胞株体外增殖的抑制率

与ISL 0 μg/ml组比较:1)P<0.05

2.3 Western印迹检测自噬相关蛋白Beclin1、LC3的表达 ISL处理细胞后，随着浓度的增加，Beclin1、LC3蛋白表达增加。ISL 5、10 μg/ml组与0 μg/ml组比较差异显著(P<0.05)，见图2。

图1 吖啶橙/溴乙啶双染后观察SKOV3细胞的形态改变(×200)

图2 ISL作用于SKOV3细胞株后 LC3和Beclin1的蛋白水平变化

3 讨 论

卵巢癌是一种女性生殖系统恶性肿瘤，早期症状不明显，也没有可靠的筛选方法，导致大多数患者就诊时都已经到了晚期，治愈成功率非常低〔2〕。目前卵巢癌常用治疗方法是外科手术，并辅以铂类药物进行化疗，但是铂类药物会产生较大的不良反应，长时间使用将会产生耐药性〔3〕，从而导致治疗失败，患者的生存率非常低〔4〕。本实验采用的ISL在治疗这种疾病方面具有较好疗效，且具有不良反应小、不容易产生耐药性等优点〔5〕。本研究也证实，ISL对人卵巢浆液性乳头状腺癌SKOV3细胞株体外增殖有明显的抑制作用，并且存在量效与时效的正比例关系。ISL还能够增加SKOV3细胞自噬发生率，自噬水平随着药物浓度升高而升高，细胞形态也会发生变化〔6，7〕。

综上所述，ISL对人SKOV3细胞株体外增殖有明显的抑制与诱导自噬作用，目前只是证明其是一种有效的治疗检测手段，期待在进一步研究中出现更有意义的发现。

1 张栋栋，付亚杰，陈小芸，等.异甘草素诱导人卵巢癌细胞株SKOV3凋亡及自噬的研究〔J〕.重庆医学，2015；44(3)：315-7.

2 Kim JR，Kim BM，Kim YM，etal..Colonic metastasis presenting as an intraluminal fungating mass 8 years after surgery for ovarian cancer〔J〕.Ann Coloproctol，2015；31(5)：198-201.

3 Weng Z，Gao H，Hu J，etal.Isoalantolactone induces autophagic cell death in SKOV3 human ovarian carcinoma cells via upregulation of PEA-15〔J〕.Oncol Rep，2016；35(2)：833-40.

4 宋文爽，叶 元.Vandetanib对人卵巢癌细胞抑制作用机制探讨〔J〕.中华肿瘤防治杂志，2014；21(20)：1589-93.

5 刘 俊，蔡云朗，任慕兰，等.PI-103对人卵巢癌细胞株 SKOV3/DDP顺铂化疗效果的影响〔J〕.东南大学学报(医学版)，2013；32(5)：574-9.

6 Choi CH，Sung CO，Kim HJ，etal.Overexpression of annexin A4 is associated with chemoresistance in papillary serous adenocarcinoma of the ovary〔J〕.Human Pathol，2013；44(6)：1017-23.

7 Yuan X，Yu B，Wang Y，etal.Involvement of endoplasmic reticulum stress in isoliquiritigenin-induced SKOV-3 cell apoptosis〔J〕.Recent Pat Anticancer Drug Discov，2013；8(2)：191-9.

〔2015-12-15修回〕

(编辑 李相军)

洪铭岩(1978-)，男，副主任医师，主要从事外科肿瘤方面的研究。

王 颖(1977-)，女，主治医师，主要从事妇产科肿瘤方面的研究。

R737.3

A

1005-9202(2016)20-5000-02；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.025

1 唐山市工人医院外科