宁痫颗粒联合卡马西平对难治性癫痫模型大鼠炎症反应的影响

2016-11-28仝秀清

中国老年学杂志 2016年20期

关键词：卡马西平难治性癫痫

薛韬仝秀清

(内蒙古医科大学附属医院神经内科，内蒙古呼和浩特 010059)

宁痫颗粒联合卡马西平对难治性癫痫模型大鼠炎症反应的影响

薛韬仝秀清

(内蒙古医科大学附属医院神经内科，内蒙古呼和浩特 010059)

目的探讨宁痫颗粒联合卡马西平对难治性癫痫模型大鼠炎症反应的抑制作用。方法 SD雄性大鼠随机分为正常对照组、模型组、宁痫颗粒组、卡马西平组以及联合组，采用海马CA3局部注射海人酸方法制作大鼠癫痫模型，造模后用苯妥英钠灌胃14 d对模型进行筛选。继续饲养2 w后股动脉取血并分离血清，检测各组大鼠血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-6及促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量变化。结果模型组中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达均明显高于正常对照组(P<0.05)；宁痫颗粒组和卡马西平组中三种因子表达显著下降(P<0.05)，且联合组中IL-1β、IL-6和TNF-α的表达下降最显著(P<0.05)。结论宁痫颗粒联合卡马西平具有明显的免疫抑制作用，比两药单用效果突出。推测两药可能通过协同作用抑制炎症反应进而阻断癫痫发作，达到治疗癫痫的目的。

难治性癫痫；宁痫颗粒；卡马西平

癫痫(epilepsy)是大脑神经元突发性异常持续放电，导致短暂大脑功能障碍的一种慢性疾病〔1〕。尽管目前多数癫痫发作经药物治疗可得到控制，但有部分患者对抗癫痫药物治疗反应差，癫痫发作难以控制，称为难治性癫痫(IE)。虽然通过外科手术可以控制癫痫发作，但仍然有大约半数的IE患者外科治疗无效或无手术适应证。最新研究发现癫痫病理机制与炎症反应息息相关，而临床上，激素和免疫球蛋白也已经用于IE的治疗〔2〕。但迄今为止，对IE患者血清非特异性炎症指标的研究极为有限。本实验通过检测IE模型大鼠血清中白细胞介素(IL)-1β、IL-6及促炎因子肿瘤坏死因子(TNF)-α的含量间接反映IE大鼠炎症反应发展程度，探究宁痫颗粒联合卡马西平对IE大鼠免疫机制方面的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物及试剂健康清洁级雄性SD大鼠100只。动物生产许可证号：SCXK(豫)2015-18。造模前每组均以大鼠标准饲料(郑州大学第一附属医院动物实验中心提供)喂养，自由饮水，适应性喂养至体重(250±20)g后进行造模及后续实验。

宁痫颗粒药物组成：青黛、石菖蒲、全蝎，均购于郑州大学第一附属医院中药房。卡马西平片(江苏恩华药业，生产批号：H321502);苯妥英钠片(北京双鹤药业股份有限公司，生产批号：H19621702)；IL-1β、IL-6、TNF-α ELISA试剂盒均购自北京索莱宝科技有限公司，生产批号：S10J0351。

1.2 方法

1.2.1 IE模型大鼠制备 10%水合氯醛(4 ml/kg)腹腔注射麻醉后，将头部固定于脑立体定位仪上，剪毛、酒精消毒，沿大鼠头部正中线作1 cm的纵向切口，3%双氧水腐蚀颅骨上腱膜及颅骨外膜，暴露前囟和冠状缝。选择右侧海马CA3中心区(AP:-4.00 mm,ML:4.40 mm,DV:3.8 mm)作为药物注射靶点。用颅骨钻小心钻透颅骨至硬脑膜，不要伤及皮层，在钻孔处用微量注射器注入2 μl海人酸(0.5 μg/μl)，微量注射器下针至硬脑膜下3.8 mm，在10 min内缓慢将海人酸注入右侧海马CA3中心区，留针5 min，钟表螺丝封口，在对应的左侧区域钻孔上钟表螺丝，并用牙科水泥封口，将电极接在钟表螺丝上面，术后缝合头皮。正常对照组除用生理盐水代替海人酸外，其他操作相同。待癫痫模型制作完成后，以苯妥英钠(0.03 g/kg,1.2 mg/ml)口服给药14 d，行为学观察大鼠仍有部分复杂性发作，脑电图记录有癫痫波者，证实IE大鼠造模成功。

1.2.2 分组及给药 IE大鼠模型制备过程中死亡7只，24只因癫痫发作情况不符合要求而弃用。剩余符合条件的大鼠随机分为模型组、宁痫颗粒组、卡马西平组以及联合组各9只，且每组给予相对应的药物(按照临床常用饮片剂量折算)灌胃14 d进行干预，正常对照组和模型组给予等量的生理盐水作为对照。

1.2.3 检测指标采用股动脉取血法收集各组大鼠动脉血5 ml于真空抗凝采血管，4℃，4 000 r/min低温离心15 min，分离取上清液，采用ELISA方法，严格按照相应ELISA试剂盒操作说明，检测各组大鼠血清中炎症因子IL-1β、IL-6和促炎因子TNF-α的含量变化。

1.3 统计学方法应用SPSS18.0软件，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较行t检验。

2 结果

与正常对照组相比，模型组炎症因子IL-1β、IL-6和促炎因子TNF-α的表达显著升高。单用宁痫颗粒或卡马西平进行药物干预后，三种因子的表达较模型组均有所下降，但联合组干预后对三种因子的抑制最明显(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α水平比较

1)与正常对照组比较，2)与模型组比较，3)与宁痫颗粒组比较，4)与卡马西平组比较：均P<0.05

3 讨论

癫痫的发病机制至今尚未阐明，越来越多的研究表明，炎症过程与癫痫的发作密切相关〔3，4〕。对IE患者术后脑组织神经病理切片检测发现，脑内存在一种持续且复杂的炎症反应〔5〕。在动物实验中发现，脑部炎症反应和癫痫进程之间互为因果〔6〕。现已证实高迁移率族蛋白1/Toll样受体4(HMGB1/TLR4)信号通路与IE密切相关，激活HMGB1/TLR4 通路主要生成与释放炎症因子IL-6、IL-1β以及促炎因子TNF-α 等细胞因子〔7〕。TLR4可与巨噬细胞、中性粒细胞分泌的HMGB1结合，促使核因子(NF)-κB活化诱导炎症发生，激活后可通过NF-κB信号途径生成并释放大量的促炎细胞因子，促炎因子又可以反过来促进HMGB1 的分泌，造成癫痫反复发作，预后不良〔8〕。故IL-6,IL-1β和TNF-α逐渐被采用作为判断癫痫发作的血清标志物。

IL-1β、IL-6以及TNF-α表达于激活的星形胶质细胞以及小胶质细胞上，在癫痫发作的脑内可检测到上述炎性因子的受体表达明显上调〔9〕。IL-1β在脑内的含量增高可加重炎症反应，引起惊厥。IL-6的过量表达可以促进小鼠海马的星形胶质细胞增生，引起海马区脑电图呈癫痫样改变〔10〕。TNF-α可以诱导T、B淋巴细胞的活化，介导脑局部组织的炎症反应，加剧IL-1β、IL-6对内皮细胞的损伤及血脑屏障的损害程度，诱导癫痫的发生〔11〕。有研究表明，IL-1β、IL-6、TNF-α对癫痫的反复发作和加剧起促进作用；同时，癫痫引起的炎症因子也会加重IE的发作与反复〔12〕。本文采用海人酸诱导大鼠IE后，检测发现模型组大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均明显升高，表明免疫细胞处于活化状态，以上三种细胞因子参与了IE大鼠的异常免疫应答，从而导致细胞因子网络失衡，进而引起细胞免疫功能紊乱。卡马西平和宁痫颗粒可能是通过直接或间接作用于HMGB1/TLR4 信号通路，抑制TLR4的活性，进而减弱其与巨噬细胞和中性粒细胞分泌的HMGB1结合，导致HMGB1/TLR4 信号途径生成与释放的IL-1β、IL-6以及TNF-α含量下降，从而抑制炎症反应，阻止脑损伤，起到保护脑细胞的作用。本研究中卡马西平和宁痫颗粒单独应用的疗效弱于联合应用组，推测卡马西平和宁痫颗粒都只是干预HMGB1/TLR4 信号途径的某一局部反应，而两药联合应用后全面抑制整条通路，促使炎症因子的表达下降更为明显。

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