骨痹颗粒防治兔骨关节炎的作用及机制

周玲玲 刘 慧 周 聪 耿 姗 周学平

(南京中医药大学，江苏 南京 210023)



骨痹颗粒防治兔骨关节炎的作用及机制

周玲玲 刘 慧 周 聪 耿 姗 周学平

(南京中医药大学，江苏 南京 210023)

目的 观察骨痹颗粒对兔骨关节炎(OA)的治疗作用机制。方法 兔随机分为正常对照组、模型组、塞来昔布组及骨痹颗粒2.78，5.56，11.12 g生药/kg三个剂量组；采用兔关节腔注射木瓜蛋白酶法建立OA模型，连续给药8 w，检测家兔血清中白细胞介素(IL)-1β、前列腺素(PG)E2、基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1含量及关节液中诱导型一氧化碳合酶(iNOS)和一氧化氮(NO)水平，观察兔关节病理组织学变化。结果 骨痹颗粒5.56，11.12 g生药/kg可抑制炎症因子IL-1β及PGE2的生成，降低MMP-1及MMP-3水平，提高TIMP-1水平，抑制关节液中iNOS表达及NO释放，减轻关节软骨病变，降低关节Mankin评分。结论 骨痹颗粒对兔OA具有良好的治疗作用，其机制与抑制炎症介质和炎性因子生成、调节基质合成与分解代谢平衡有关。

骨痹颗粒；骨关节炎；炎性因子；金属蛋白酶

骨关节炎(OA)是机械力学和生物学事件的共同作用下所导致的关节的软骨细胞、细胞外基质(ECM)，及软骨下骨的降解和合成作用之间失衡的结果〔1〕，流行病学调查结果显示50岁以上人群OA致残率在长期致残疾病排名中仅次于心血管疾病〔2〕，因此，OA的防治也成为医学界研究的热点。中医药在防治骨关节疾病方面具有独特疗效，周仲瑛教授结合临床应用数十年的经验，采用桑寄生、怀牛膝、川断等8味中药，通过现代方法精制成骨痹颗粒，临床研究证明该药可有效抑制炎症，延缓关节退变，减轻患者痛苦。为了进一步明确其对OA的疗效，本课题采用关节腔注射木瓜蛋白酶建立家兔骨关节炎的模型，观察骨痹颗粒对其作用及机制。

1 材料与方法

1.1 药物与试剂 骨痹颗粒由江苏省植物药研究与新药开发中心提供，含6 g生药/g；塞来昔布，辉瑞制药有限公司；兔IL-1β、前列腺素(PG)E2、基质金属蛋白酶(MMP)-1、MMP-3、基质金属蛋白酶组织抑制因子(TIMP)-1酶联免疫分析试剂盒，均购自上海源叶生物科技有限公司；一氧化氮(NO)及诱导型一氧化氮合酶(iNOS)检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 仪器 Synergy HT型酶标仪，美国Bio-Tek公司；TS25-WS型离心机，上海卢湘仪仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 骨关节炎模型的建立〔3,4〕将兔固定于兔台，膝关节备皮，消毒并屈曲右膝关节，于髌韧带附着点外上方约 0.5 cm处进针，将0.3 ml 1.6%木瓜蛋白酶注入关节腔内，每隔3 d注射1次，共注射3次。正常对照组注射等体积的生理盐水。

1.3.2 分组及给药 家兔48只，体重2～2.5 kg，由南京中医药大学实验动物中心提供，合格证号：SCXK(苏)2012-0008。雌雄各半，随机分为6组：分别为①正常对照组；②模型组；③塞来昔布组：7.67 mg/kg；④骨痹颗粒低剂量组：2.78 g生药/kg；⑤中剂量组：5.56 g生药/kg；⑥高剂量组：11.12 g生药/kg。各组于造模完成后次日开始分别灌胃给予相应的药物，给药体积为3 ml/kg，正常对照组和模型组给予等体积生理盐水，每日1次，共8 w。

1.3.3 指标检测 给药结束后各组家兔心脏取血，离心取血清，ELISA法检测血清中IL-1β、PGE2、MMP-1、MMP-3、TIMP-1的含量；处死家兔，用注射器抽取1 ml生理盐水，注入关节腔，反复屈膝后抽取关节液，离心后测定关节液中NO及iNOS含量；取造模侧关节股骨内髁固定，常规处理，切片，行HE染色作病理组织学检查，阿尔新兰染色观察基质染色情况，并按照Mankin评分标准进行评分〔5〕。

1.4 统计学方法 采用Graph Pad Prism 5软件进行单因素方差分析。

2 结 果

2.1 骨痹颗粒对OA兔血清中IL-1β、PGE2含量的影响 模型组较正常对照组兔血清中IL-1β、PGE2含量均显著升高(P<0.01)，骨痹颗粒中、高剂量组与模型组比较，血清中IL-1β、PGE2含量均明显降低(P<0.05，P<0.01)，且存在一定的剂量依赖性。见表1。

表1 骨痹颗粒对OA兔血清IL-1β、PGE2含量的影响

与正常对照组比较：1)P<0.01；与模型组比较：2)P<0.05，3)P<0.01；下表同

2.2 骨痹颗粒对OA兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影响 模型组兔血清中MMP-1、MMP-3含量较正常对照组明显升高，TIMP-1含量较正常对照组明显降低(P<0.01)，骨痹颗粒中、高剂量组血清MMP-1、MMP-3含量较模型组明显降低，TIMP-1含量较模型组明显升高(P<0.05，P<0.01)。见表2。

表2 骨痹颗粒对兔血清MMP-1、MMP-3、TIMP-1含量的影响

2.3 骨痹颗粒对OA兔关节液NO、iNOS含量的影响 模型组兔关节液NO、iNOS含量较正常对照组明显升高(P<0.01)；骨痹颗粒低剂量组兔关节液NO含量明显低于模型组(P<0.05)，但iNOS含量变化较模型组无明显降低；骨痹颗粒中、高剂量组兔关节液NO 、iNOS含量较模型组均有显著下降(P<0.01)。见表3。

表3 骨痹颗粒对兔关节液NO 、iNOS含量的影响

2.4 骨痹颗粒对OA兔关节软骨病理组织学改变的影响 家兔关节病理组织学检查结果显示：正常对照组兔关节软骨结构完整，表面光滑，无裂隙，分层规则，细胞排列整齐，潮线清晰完整。模型组兔关节软骨表面粗糙不平，出现裂隙，分层不清晰，结构紊乱，软骨细胞中度或重度增生，伴有大量簇集现象，潮线模糊，或被血管穿过。骨痹颗粒低剂量组兔关节软骨细胞排列紊乱但层次可分，软骨细胞轻度至中度增生，部分有簇集现象，局部区域缺失，潮线紊乱；中剂量组兔关节软骨表面较平滑，有少许裂隙排列紊乱但层次可分，软骨细胞排列整齐，轻度增生，潮线完整，可见多层次潮线；高剂量组兔关节软骨表面较平滑，分层基本清楚，细胞轻度增生，潮线清晰可见。见图1。兔软骨Mankin评分结果显示：模型组兔关节Mankin′s评分较正常对照组明显升高〔(8.00±1.31)vs(0.00±0.00)，P<0.01〕；骨痹颗粒中、高剂量组兔关节Mankin评分〔(6.25±1.83)，(6.13±1.55)〕较模型组明显降低(P<0.05)。塞来昔布组、骨痹颗粒低剂量组〔(6.57±2.07)、(7.50±1.52)〕与模型组无显著差异(P>0.05)。

图1 各组兔关节病理组织学改变(HE，×40)

3 讨 论

OA主要病理改变为软骨退行性病变、基质降解、骨赘形成等。周仲瑛教授根据数十年临床经验确立补肾蠲痹通络法治疗OA〔6〕，据此选药组成骨痹方。方中桑寄生益肝肾、祛风湿、强筋骨，鸡血藤养肝血、柔筋脉、和血络，两者共为君药。怀牛膝、川断、骨碎补共为臣药，补肝肾、强筋骨、活血止痛，增强桑寄生补肝肾、强筋骨的功效。千年健和土鳖虫共为佐药，祛风湿、破瘀血、壮筋骨、止痛消肿；油松节祛风湿、通络止痛，善走骨节、直达病所为使药。诸药合用共奏平补肝肾、蠲痹通络之功效，可延缓关节软骨的退行性变，充分体现治病求本之旨。

课题首先采用木瓜蛋白酶关节腔内注射诱发兔OA，动物可观察到关节病变，炎症性细胞因子过度分泌和金属蛋白酶水平异常等症状，与人骨关节炎病理变化较为类似。在此基础上观察骨痹颗粒的作用，结果显示其可以减轻兔骨关节病理组织学改变，降低Mankin评分，表明其对OA的局部病变有较好的作用。细胞因子的合成与分解途径的失衡是OA关节软骨毁损中最为基本的因素，其中IL-1β的大量释放，可刺激软骨细胞和滑膜产生MMPs，促进软骨基质的降解，还可诱导环氧化酶(COX)-2和iNOS的表达，促进PGE2、NO的合成〔7,8〕。PGE2可增加毛细血管通透性，抑制蛋白多糖合成，激活MMPs，并促进胶原酶产生，导致软骨基质降解破坏〔9,10〕。此外，PGE2对IL-1β的表达具有正反馈的作用，从而进一步诱导软骨细胞凋亡〔11〕。高水平的NO在OA可促进PGE2释放，加重炎症反应，诱导软骨细胞凋亡，还能激活多种潜在的胶原酶、明胶酶和组织纤溶酶原激活物，抑制软骨基质合成，促进Ⅱ型胶原降解，最终导致软骨进行性退化〔12,13〕。本研究结果显示，骨痹颗粒能够明显抑制OA兔血清中IL-1β、PGE2等炎症因子的产生，并进一步抑制兔关节腔内iNOS的过度表达，减少NO的分泌，提示抑制炎症性细胞因子和炎症介质的释放是其治疗OA的机制之一。

细胞外基质主要由胶原与蛋白多糖构成，是软骨的主要组成部分，在维持软骨功能方面有着重要的作用，其合成与降解代谢保持动态平衡〔14〕。MMPs是基质降解的主要介质，其中MMP-1和MMP-3是参与软骨基质降解的重要介质，并受TIMP-1的调节〔15〕，目前已作为判断疗效的指标之一。本课题研究结果表明骨痹颗粒可改善基质代谢平衡，延缓关节软骨退变。炎症因子IL-1β等的升高，也可刺激软骨及滑膜MMPs表达上调，TIMPs表达下调，导致MMPs/TIMPs的平衡遭到破坏，因此推测骨痹颗粒对MMP的作用除直接作用外，还可能与其抑制炎症因子的作用相关。

综上，骨痹颗粒可保护OA动物的关节软骨，延缓软骨退变的发生与发展，抑制炎症因子的生成，调节基质代谢平衡，对OA具有良好的防治作用。

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〔2015-05-25修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

江苏省科技厅社会发展项目(No.BE2011847)

周玲玲(1974-)，女，博士，副教授，硕士生导师，主要从事中药药理学、免疫药理学等方面研究。

R285.5

A

1005-9202(2016)20-4975-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.015