紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞增殖与凋亡的影响

马永臻

(山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000)



紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞增殖与凋亡的影响

马永臻

(山东医学高等专科学校，山东 临沂 276000)

目的 探讨紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞增殖与凋亡。方法 用划痕实验检测紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞增殖、迁移能力的影响；MTT法和免疫细胞化学方法检测紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞中Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的影响。结果 紫杉醇和顺铂明显抑制KYSE150细胞的增殖，降低其迁移能力(P<0.05)，且两药有协同抑制作用。紫杉醇和顺铂降低KYSE150细胞中Bcl-2蛋白的表达，增强Bax和Caspase-3蛋白的表达(P<0.05)。结论 紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞增殖和凋亡影响与Bax、Bcl-2和Caspase-3基因表达异常相关。

紫杉醇；顺铂；Bax；Bcl-2；Caspase-3；食管癌

早期食管癌的治疗以手术切除为主，晚期常以化疗为主，但食管癌发病隐匿，确诊时大多已是中晚期，失去了根治的机会，导致食管癌治疗的总有效率并不高。因此，寻找对食管癌更有效的治疗方法和化疗药物具有重要意义。紫杉醇和顺铂是临床常用的食管癌化疗药物，但对其作用机制尚未完全清楚。食管癌的发生、发展与细胞凋亡异常密切相关，而细胞凋亡又是由多种基因调控的，研究凋亡调控基因对于了解食管癌的发生、发展及治疗都有重要意义。本文观察紫杉醇和顺铂对食管癌KYSE150细胞增殖和凋亡的影响，检测Bax、Bcl-2和Caspase-3基因表达变化，探紫杉醇和顺铂的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 RPMI1640培养液、胰蛋白酶和胎牛血清由杭州四季青公司提供。人食管癌KYSE150株由本实验室冻存。紫杉醇(分子量853.9)、顺铂(分子量300.05)由哈药集团生物工程有限公司提供，5%四甲基偶氮唑蓝(MTT)由上海华美生物工程公司提供。兔抗人Bax、Bcl-2和Caspase-3单克隆抗体由美国Santa Cruz公司提供，FITC标记的羊抗兔IgG、山羊封闭血清、二甲基亚砜(DMSO)、DAB显色剂和PBS购自北京中杉金桥生物科技有限公司。

1.2 细胞培养 KYSE150细胞接种于RPMI1640培养基(含10%胎牛血清，100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素)，常规培养，隔天更换培养液并传代，取对数生长期的细胞用于实验。

1.3 MTT法检测

1.3.1 半数抑制浓度(IC50)测定 取100 μl含5×104个/ml细胞接种于96孔板。孵育12 h后，加入不同浓度的顺铂和紫杉醇，顺铂终浓度依次为4、8、16、32、64、128、256 μg/ml，紫杉醇终浓度分别为0.5、1、2、4、8、16、32 μg/ml，每孔100 μl，每个浓度设3个复孔，以不含药物的培养液作为阴性对照孔，同样设3个复孔。继续培养48 h后加入MTT溶液(5 mg/ml)20 μl/孔，孵育4 h，吸去孔内培养液，加150 μl DMSO，振荡10 min。用全自动酶标仪测定490 nm处吸光值(A)。细胞生长抑制率(%)=(1-实验组A值/对照组A)×100%。计算出顺铂、紫杉醇对人食管癌细胞KYSE150的IC50。实验重复3次。

1.3.2 药物联合作用评价 细胞分如下4组：对照组、紫杉醇组、顺铂组和联合组(紫杉醇+顺铂)，对照组不加药物，紫杉醇和顺铂的浓度均为IC50。倒置显微镜下观察各组细胞形态；全自动酶标仪检测药物作用24、48、72 h后各组细胞的吸光值，比较不同药物和用药方式对KYSE150细胞增殖的影响。实验重复3次。采用两药相互作用指数(CDI)评价两药的相互作用〔1〕：CDI=AB/(A×B)，其中A、B是两药单独作用吸光度值与对照组吸光度值的比值，AB为两药联合组吸光度值与对照组吸光度值比值。CDI>1时，两药相互作用为拮抗作用；CDI=1，两药作用性质为相加；CDI<1时，两药相互作用为协同。

1.4 免疫细胞化学染色 KYSE150细胞按照1.3.2方法分组培养，至细胞完全贴壁后加紫杉醇和顺铂(均为IC50的浓度)。继续培养48 h后收集细胞，涂片，固定，3%H2O2室温孵育15 min，山羊血清孵育15 min。分别与Bax、Bcl-2和Caspase-3单克隆抗体37℃孵育2 h，PBS洗3次。二抗室温孵育15 min，DAB显色，封片，以培养液代替一抗作阴性对照。显微镜下观察切片，以细胞膜和细胞质中出现棕黄色细颗粒为阳性细胞，比较各组细胞阳性着色的位置和强度，计算KYSE150细胞Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的阳性率。应用Image J软件和Image Proplus软件对免疫组化图像进行半定量分析。

1.5 划痕实验检测紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞生长和迁移的影响 取对数期各组细胞接种于6孔板，细胞密度为5×103个/孔，待细胞贴壁成单层细胞后，用消毒枪头均匀划4条横线，用PBS洗去划下的细胞，换成含1.5%胎牛血清的培养基培养，置于37°C，5%CO2孵箱内培养。显微镜下观察0、24、48 h划痕愈合情况，用Image Proplus软件测量各组细胞24 h的迁移距离，每组实验重复3次。

1.6 统计学方法 采用SPSS16.0统计软件进行t检验。

2 结 果

2.1 IC50测定 见表1。随着紫杉醇和顺铂浓度增加，KYSE150细胞的抑制率也增加，当紫杉醇浓度为8 μg/ml、顺铂的浓度为64 μg/ml时，细胞的抑制率近半数，因此，可以认为紫杉醇的IC50为8 μg/ml，顺铂的IC50为64 μg/ml。

表1 紫衫醇和顺铂IC50测定

2.2 紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞增殖的影响 显微镜下观察，紫杉醇组、顺铂组和联合组细胞稀疏，形态皱缩、变圆，胞核固缩；对照组细胞密集，贴壁良好，形态规则，多边形。说明紫杉醇和顺铂对食管癌细胞有明显的抑制作用。紫杉醇和顺铂对KYSE150细胞增殖抑制作用并无时间依赖性，48 h时抑制作用最强(CDI=0.742)，72 h后抑制作用减弱(CDI=0.922),24 h时CDI=0.878；各时间点CDI<1，说明紫杉醇和顺铂有协同作用，而且48 h协同作用最强。见表2。

表2 紫杉醇和顺铂作用不同时间的平均吸光度值比较

与同组别其他时间点比较：1)P<0.05;与同时间点其他组比较：2)P<0.05

2.3 免疫细胞化学结果 各组平均灰度值见表3，各用药组Bcl-2蛋白的表达均低于对照组，Bax和Caspase-3蛋白的表达均高于对照组。应用Image J软件对免疫组化图像进行阳性细胞计数，见表4，阳性细胞越多，说明表达Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白的表达越多(P<0.05)。

表3 Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白表达的平均灰度值

与对照组比较:1)P<0.05，下表同

表4 免疫组化图像阳性细胞数分析(%,n=100)

2.4 划痕实验结果 划痕实验结果显示，对照组细胞生长较快，48 h后细胞已经长满划痕部位，而顺铂组细胞生长缓慢，48 h后划痕部位没有长满。用Image Proplus软件测量各组细胞24 h的迁移距离，结果表明对照组迁移距离明显大于顺铂组(P<0.05)，见表5。

表5 各组细胞24 h、48 h迁移距离

3 讨 论

紫杉醇和顺铂已经广泛应用于食管癌的治疗，效果较好〔2,3〕。本研究发现，随着紫杉醇和顺铂浓度的增加，对KYSE150细胞的抑制作用增强，当紫杉醇浓度为8 μg/ml、顺铂的浓度为64 μg/ml时，细胞的抑制率近半数，但紫杉醇和顺铂的抑制作用并无时间依赖性，48 h时抑制作用最强，72 h后抑制作用减弱，而且紫杉醇和顺铂有协同作用。章晓萍等〔4〕研究发现，顺铂与吉非替尼联合用药对食道癌Eca-109细胞有协同抑制作用，细胞的生长抑制率均随着给药浓度的增加和时间的延长而提高,顺铂组具有时间浓度依赖性,与本研究略有不同之处。

细胞增殖失控是恶性肿瘤重要的生物学特征，细胞增殖与凋亡失衡是食管癌发生的重要原因，细胞凋亡又受许多基因的调控，其中Bax、Bcl-2和Caspase-3都与细胞凋亡有关。孔霞等〔5〕研究证实，顺铂与紫杉醇联合可协同诱导人食管癌细胞的凋亡，其作用机制可能与下调凋亡抑制基因的表达有关。原癌基因Bcl-2基因家族及其相关蛋白是研究最早的与凋亡有关的基因，也是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族〔6〕。Bcl-2家族成员分为两大类：促凋亡类，如Bid、Bax、Bak等；抑凋亡类，如Bcl-2、Bcl-x1等，这2类蛋白可通过形成异二聚体发挥相互拮抗或协同作用〔7〕。Bcl-2基因高表达可以抑制细胞凋亡，维持细胞的存活，而对细胞增殖无影响。

Bax基因定位于染色体19q13.3-19q13.4,含有6个外显子5个内含子。Bax和Bcl-2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡，当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡；Bax与Bcl-2形成异源二聚体时则实现了Bcl-2抑制细胞凋亡的功能〔7〕。

本研究说明紫杉醇和顺铂使得Bcl-2蛋白表达降低，Bax和Caspase-3的表达增高，对KYSE150细胞凋亡的抑制作用减弱，诱导凋亡的作用增强，从而抑制细胞的增殖，抑制食管癌的进一步发展。这一结果与某些实验结果一致〔8,9〕。

细胞凋亡是非常复杂的蛋白酶级联反应过程。目前认为药物诱导肿瘤细胞的凋亡受一个或多个基因的调控〔10〕。众所周知，Caspase-3为与细胞凋亡密切相关的蛋白酶家族〔11〕。诱导细胞凋亡的典型途径包括：对Caspase-3的依赖性(细胞外途径)和对线粒体靶向性(细胞内途径)，而Caspase-3是两种细胞凋亡途径中的关键酶和执行者，是级联反应的必经之路。由于活化的Caspase-3能特异性地切断DNA，使参与DNA损伤修复过程中的DNA依赖蛋白激酶(DNA-PK)和聚ADP核糖聚合酶(PARP)失活，导致核酸激活和染色质聚集，促使细胞凋亡。Odonkor等〔12〕研究结果表明，Caspase-3依赖性途径是Paclitaxel细胞毒性作用的重要途径，Caspase活化和效能对Paclitaxel治疗肿瘤的敏感性具有良好的指示作用。刘圆圆等〔13〕研究发现茶多酚能抑制Eca-109细胞生长、诱导细胞凋亡，使细胞周期阻滞在G1期的比例增高；两药联合其作用更明显，其机制可能与Caspase-3 mRNA表达增高有关。从作用机制而言，Bcl-2不仅可能通过抑制细胞色素C从线粒体的释放而调控线粒体渗透性转换孔的开启从而抑制Caspase-3的活化，还可能参与抑制Caspase-3的合成〔14〕。

1 Cao SS,Zhen YS.Potentiation of antimetabolite antitumor activity in vivo by dipyridamole and amphotericin B 〔J〕.Cancer Chemother Pharmacol,1989；24(3):181-6.

2 孙兆勇,王传省.紫杉醇脂质体联合奥沙利铂、5-氟尿嘧啶治疗晚期食管癌的疗效〔J〕.中国老年学杂志,2013；33(12):2927-8.

3 丁金锋.顺铂与紫杉醇同步化疗联合放疗治疗老年食管癌疗效观察〔J〕.中国实用医药,2012；7(22):143-4.

4 章晓萍,李孝麟.吉非替尼联合顺铂对食管癌细胞增殖的影响〔J〕.海峡药学,2012；24(8):240-2.

5 孔 霞,王秀美,隋爱华，等.重组人血管内皮抑素与紫杉醇联合诱导人食管癌细胞 Eca-109 凋亡的实验研究〔J〕.临床肿瘤学杂志,2013；18(3):193-6.

6 Adams JM,Cory S.Bcl-2-regulated apoptosis:mechanism and therapeutic potential〔J〕.Curr Opin Immunol,2007；19(5):488-96.

7 Lalier L,Cartron PF,Juin P,etal.Bax activation and mitochondrial insertion during apoptosis〔J〕.Apoptosis,2007；12(5):887-96.

8 Xu XY,Liu YQ,Wang L,etal.Gambogic acid induces apoptosis by regulating the expression of Bax and Bcl-2 and enhancing caspase-3 activity in human malignant melanoma A375 cell〔J〕.Int J Dermatol,2009；48(2):186-93.

9 孟显峰,宋 扬,杨伟品.IP6诱导肝癌细胞HepG2凋亡及其对Bcl-2和Bax蛋白表达影响〔J〕.青岛大学医学院学报,2011；47(4):311-3.

10 金 鑫,姚良萍,卢 云.康莱特对HepG2细胞凋亡及其Caspase-3和Survivin表达影响〔J〕.齐鲁医学杂志,2012；27(1):1-3.

11 Pop C,Salvesen GS.Human caspases:activation,specificity,and regulation〔J〕.J Biol Chem,2009；284(33):21777-81.

12 Odonkor CA,Achilefu S.Differential activity of caspase-3 regulates susceptibility fo lung and breast tumor celllines to Paclitaxel〔J〕.Open Biochem J,2008；2(22):121-8.

13 刘圆圆，王秀美，姚如永，等.茶多酚并紫杉醇对食管癌Eca-109细胞增殖与凋亡影响〔J〕.齐鲁医学杂志,2013；28(2):102-5.

14 单玉兴,张海玉,王立君,等.藤黄酸对骨肉瘤中hTERT和Bcl-2蛋白的影响〔J〕.中国实验诊断学,2013；17(5):826-8.

〔2015-04-15修回〕

(编辑 苑云杰/曹梦园)

山东省医药卫生科技发展计划(2011HZ098)

马永臻(1970-)，女，硕士，教授，主要从事肿瘤病理研究。

R735.1

A

1005-9202(2016)20-4973-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.014