电针对高脂血症新西兰兔脂肪组织脂联素mRNA表达的影响

兰彩莲 萨喆燕 董亚琴 万 隆 程佑民 郑淑霞 许金森

(福建省中医药研究院，福建 福州 350003)



电针对高脂血症新西兰兔脂肪组织脂联素mRNA表达的影响

兰彩莲 萨喆燕 董亚琴 万 隆 程佑民 郑淑霞 许金森

(福建省中医药研究院，福建 福州 350003)

目的 探讨电针胃经穴位对高脂血症新西兰兔血脂及脂肪组织脂联素mRNA表达的影响。方法 取24只雄性新西兰兔，随机数字法分为高脂血症组和正常对照组各12只。造模8 w以后，上述两组再各自随机分为电针组和对照组各6只。电针10 d后，7180型日立自动分析仪测定所有新西兰兔的血脂四项，Real Time PCR法检测新西兰兔腹腔脂肪组织脂联素mRNA表达。结果 造模后高脂血症组的甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)明显高于正常对照组，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)明显低于正常对照组(均P<0.05)，显示造模成功。电针后高脂电针组的血清TC水平明显低于高脂对照组(P<0.05)。电针后高脂电针组脂肪组织脂联素mRNA表达量明显高于高脂对照组(P<0.05)。结论 电针新西兰兔胃经穴位可以有效降低血脂和增强脂肪组织脂联素基因表达，对改善高脂血症有一定作用。

高脂血症；胃经；电针；脂联素

脂联素是与代谢综合征、肥胖、糖尿病和高脂血症等疾病相关的蛋白，其含量变化可以为疾病的预后及治疗提供参考。本实验通过饮食造模营养性肥胖新西兰兔，电针特定穴位后观察新西兰兔血脂和脂肪组织脂联素基因表达情况，试图从生化和分子层面为临床电针疗法获得实验证据的支持。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器 主要仪器：7180型日立自动分析仪(日本日立公司)，7500 FAST型实时荧光定量PCR仪(美国ABI公司)，ALLEGRA 64R型台式高速冷冻离心机(美国贝克曼公司)，微量加样枪(德国Eppendorf公司)，YLS-Q3多功能兔固定架(上海继德教学实验器械厂)，华佗牌SDZ-Ⅱ型电子针疗仪(苏州医疗用品厂有限公司)，华佗牌无菌针灸针(规格0.35 mm×25 mm，批号SD13A1105)。

主要试剂：Trizol试剂，异丙醇，乙醇，氯仿(广州化学制剂厂)，RNA Store样本保存液(TIANGEN公司)，SYBR Premix Ex Taq，ROX Reference Dye Ⅱ，脂联素引物(TAKARA公司)，甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LCL-C)检测试剂盒(宁波美康生物科技股份有限公司，批号：14100901)。

1.2 实验动物 清洁级雄性新西兰兔24只，体质量(1.5±0.3)kg，上海市松江区松联实验动物场提供，实验动物许可证号：SCXK(沪)2012-0011，饲养于福建省中医药研究院动物房(普通级)，饲养温度25℃～28℃，相对湿度50%～70%。实验动物条件符合国家科学技术委员会颁布的《实验动物管理条例》要求。本实验过程中对动物处置符合2006年科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》。

1.3 饲料配制 基础饲料和高脂饲料均委托厦门园泰生物科技有限公司合成。高脂饲料配方：10%猪油，10%蔗糖，1%胆固醇和79%基础饲料。

1.4 动物分组和模型建立 24只新西兰兔适应性喂养1 w后，采用随机数字法分为高脂血症组和正常对照组各12只。高脂血症组给予高脂饲料喂养，正常对照组给予基础饲料喂养，自由饮水。以高脂血症组和正常对照组血脂四项比较差异有显著性意义作为判定模型成功的标准。饲喂8 w验证造模成功后，高脂血症组随机分为高脂电针组和高脂对照组各6只，正常对照组随机分为空白电针组和空白对照组各6只。高脂电针组和空白电针组电针10 d。高脂对照组和空白对照组在电针期间同法限制固定，不作电针干预。

1.5 电针干预 造模结束第2天开始给空白电针组和高脂电针组家兔施以每天每穴15 min电针刺激，将家兔穴位区1 cm×2 cm兔毛剪除，暴露局部皮肤组织，乙醇棉球消毒，用多功能兔固定架固定家兔，待家兔安静不挣扎后进行电针治疗，使用无菌针灸针施灸于足三里穴(后肢背外侧，胫骨粗隆下部外约0.3 cm处)〔1〕和丰隆穴(小腿中点处腓骨后缘，刺入腓骨长肌与趾长伸肌之间〔2〕)，电针参数：疏密波，频率选择2档(20 Hz)，强度选择1档(1～2 V)，以新西兰兔后肢出现抖动但不挣扎为度。电针期间空白对照组和高脂对照组以同样方法抓取固定不做电针治疗，电针疗程为10 d。实验期间所有家兔按照分组继续高脂或普通饲料喂养。

1.6 血清和组织样品收集

1.6.1 血清制备 分别于造模前后，电针疗程前后禁食12 h，兔耳中央动脉采血4 ml，室温下静置后离心取血清，4 000 r/min离心15 min后分离上清液装于1.5 ml离心管，保存于-80℃冰箱备测。

1.6.2 脂肪组织样品制备 电针疗程结束后第2天，空气栓塞法处死所有新西兰兔，解剖腹腔，小心剥离腹股沟处皮下脂肪组织，取材组织约0.5 cm×0.5 cm，装于1.5 ml离心管，加入1 ml RNA Store样本保存液后，迅速放入-80℃冰箱备测。

1.7 实验指标测定

1.7.1 血脂四项检测 血清样品恢复至室温后，由7180型日立自动分析仪检测TG、TC、HDL-C和LDL-C水平，采用对应的血脂检测试剂盒，委托福建中医药大学附属康复医院检验科检测。

1.7.2 脂肪组织脂联素mRNA表达检测 ①脂肪组织样品解冻后，Trizol一步法提取总RNA。②用DNase I 消化RNA样品，去除其中可能含有的基因组DNA。用RNA纯化试剂盒纯化RNA，取RNA样品2 μl经Nanodrop2000超微量核酸蛋白测定仪测定RNA纯度和浓度。RNA样品经1%琼脂糖凝胶电泳1 h，在凝胶紫外透视仪下可观察到清晰条带，说明提取的RNA完整无降解。根据所测核酸浓度计算RNA样品加入量，采用试剂盒完成逆转录成cDNA的反应，引物序列正义：TGGGAGGAAATGCCAGTGTGT，反义：AAACAGGACTCAGCAAGAGCAAG。扩增产物长度为96 bp，委托TAKARA公司设计合成。③之后进行Real Time PCR，将配置好的混合液加到PCR Array对应的每个孔中，然后置PCR Array于实时定量PCR仪进行PCR反应，以上加样操作均为冰浴上进行。反应体系：总体积25 μl，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μl，上、下游引物各1 μl，ROXⅡ 0.5 μl，ddH2O 8 μl，cDNA 2 μl，以甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)为内参基因，每个样本做3个复孔，用相对标准曲线法检测基因表达RQ值。反应条件：①预变性95℃30 s，②95℃3 s，60℃34 s，40个循环，③95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s，60℃15 s。脂联素mRNA表达量统计分析采用2-△△Ct法，正常对照组的数值均为1。

1.8 统计学方法 应用SPSS17.0软件，所有定量数据组间比较采用同体对照t检验或者单因素方差，在方差齐性的情况下，两两比较采用LSD检验；在方差不齐的情况下，两两比较采用Dunnett′sT3检验。

2 结 果

2.1 新西兰兔造模前后体重和血脂对比 高脂饲料喂养8 w后，高脂血症组体重、TG、TC，LDL-C明显升高，HDL-C明显降低(均P<0.05)，见表1，表2。高脂血症组新西兰兔血清呈乳糜混沌状，肉眼观察及数据比较均显示高脂血症造模成功。所有家兔无死亡，无脱落。

表1 高脂血症组饲养8 w前后体重比较

与正常对照组造模后相比:1)P<0.001

表2 各组新西兰兔造模前后血脂水平比较

与高脂血症组造模前比较：1)P<0.05

2.2 新西兰兔电针前后血脂水平对比 高脂电针组电针后TC水平〔(33.99±0.84)mmol/L〕较电针前〔(35.66±0.52)mmol/L〕明显降低(P<0.05)，高脂对照组TC水平电针前〔(34.75±1.29)mmol/L〕与电针后〔(33.76±0.86)mmol/L〕无明显差异(P>0.05)。

2.3 新西兰兔电针后脂联素mRNA表达对比 与高脂对照组比较，高脂电针组的脂联素mRNA表达显著上调(P<0.05)。空白电针组与空白对照组脂联素基因的表达未见显著差异(P>0.05)。见图1。

图1 高脂血症新西兰兔电针后脂联素 mRNA的表达比较

3 讨 论

高脂血症属中医“痰湿”“脂浊”范畴。高脂血症的发生主要与脾胃肝胆失调，水谷精微生成及运化异常有关。痰湿体质、湿热体质者因体内湿浊不化、代谢不畅及湿浊困脾影响脾胃肝胆的运化和疏泄功能，因此更易罹患高脂血症。丰隆及足三里穴均为足阳明胃经之经穴，同时丰隆为胃经的络穴，沟通脾经，足三里为胃经下合穴，主治胃腑病症。丰隆穴祛痰化浊，足三里穴健脾化湿、通经活络、调和气血，所以丰隆及足三里穴是针灸临床处方中用以祛痰消瘀的首选穴位及主要配穴。

家兔作为草食性动物，其血浆脂蛋白谱与人相似，有胆固醇酯转运蛋白(CETP)、肝载脂蛋白(Apo)B100和肠ApoB48的表达，对外源性胆固醇吸收率较高，血中脂质清除率较低。高脂饮食时，血浆TC、LDL-C、VLDL/TC显著升高、HDL-C降低，易形成高脂血症和动脉粥样硬化(AS)病变。同时，家兔成模速度快，重复性好，成本低，是最早用于高脂血症研究的动物。本次实验造模结果良好，血脂水平较造模前有显著性差异，是研究高脂血症的理想动物模型。

乐薇〔3〕研究发现电针丰隆穴能降低高脂血症大鼠TC、LDL-C水平，升高HDL-C水平，改善高脂状态下血液浓、黏、聚、凝的高危险状态，减少大鼠巨噬细胞内炎症因子细胞间黏附因子(ICAM)-1、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1、肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6的含量，改善大鼠肝脏及主动脉弓形态学变化，有效抑制脂肪变性的发生程度，清除脂肪细胞，保护血管内皮，减少脂质沉积，对于As早期的血管壁具有一定的保护作用。电针丰隆穴通过提高胆固醇逆转运通路两个重要功能蛋白ATP结合盒转运蛋白A1(ABCA1)、清道夫受体BI(SR-BI)的表达，加速脂质代谢，达到治疗高脂血症的目的，电针降脂作用效果确切。本研究也显示电针特定穴位可显著改善高脂血症的高脂状态，与上述研究相似。

目前对脂联素的研究集中于肥胖、脂代谢异常、代谢综合征、2型糖尿病及冠状动脉疾病，在这些疾病中可见血清脂联素浓度降低。电针可不同程度升高脂联素的表达或血清浓度〔4〕。在脂联素基因表达方面，孙志等〔5〕研究发现针刺组脂联素高表达，与正常组大鼠相似，模型组脂联素表达很低。说明针刺具有显著促进2型糖尿病大鼠脂肪组织脂联素基因表达的作用。以往研究亦证实，脂联素在肥胖、胰岛素抵抗和2型糖尿病时的表达下降，其血浆浓度也降低，甚至其降低的程度与胰岛素抵抗和糖尿病的进展相平行〔6〕。研究还表明，脂联素血浓度与体质指数(BMI)、体脂百分数、腰/臀比、空腹胰岛素和空腹TG呈负相关，与HDL-C正相关〔7〕。机体内环境可通过脂联素与胰岛素等激素间的“胰岛素-脂联素”调节环等的自身适应性调节，使超重或轻度肥胖的患者基本保持了正常的血压、血脂和血糖水平〔8〕。因此，脂联素在高脂血症的发生发展中负有相当重要的角色，监测其指标对评价电针调脂治疗方法的疗效有重要意义。实验结果显示，电针刺激足三里和丰隆穴后，高脂血症组新西兰兔脂肪组织脂联素mRNA表达上调，与韩志敏等〔9〕报道相似。本实验还显示高脂血症组的TC水平显著上升，推测电针可能通过上调脂联素mRNA表达，激活脂肪细胞因子途径，进而通过特定通路(如肝脏Adiponectin/PPARɑ信号通路〔10〕)改善脂类代谢，发挥降低TC水平的效应。

1 王春田.基础医学实验动物操作基本技能〔M〕.北京：中国医药科技出版社，2009：136.

2 李忠仁.实验针灸学〔M〕.北京：中国中医药出版社，2006：243.

3 乐 薇.电针丰隆对高脂血症模型大鼠胆固醇逆转运通路的影响〔D〕.武汉：湖北中医药大学，2013.

4 严志康，杨智杰，陈 锋.电针对高脂血症大鼠血脂、超敏C反应蛋白、脂联素的调节作用〔J〕.针刺研究，2013；38(5)：365-8，85.

5 孙 志，马 丽，韩海荣.针刺对2型糖尿病大鼠抵抗素、脂联素及其基因表达的影响〔J〕.中国康复理论与实践，2010；16(6)：532-4，601.

6 Hotta K，Funahashi T，Bodkin NL，etal.Circulating concentrations of the adipocyte protein adiponectin are decreased in parallel with reduced insulin sensitivity during the progression to type 2 diabetes in rhesus monkeys〔J〕.Diabetes，2001；50(5)：1126-33.

7 Yamamoto Y,Hirose H,Saito M，etal.Correlation of the adipocyte-derived protein adiponectin with insulin resistance index and serum high-density lipoprotein-cholesterol，independent of body mass index，in the Japanese population〔J〕.Clin Sci，2002；103(2)：137-42.

8 张艳慧，郭素丽，王艳娜，等.大黄蛰虫丸对血脂异常大鼠脂联素及瘦素的影响〔J〕.中国老年学杂志，2011；31(19):3768-70.

9 韩志敏，侯玉铎，闫丽萍，等.电针天枢等腹部腧穴对单纯性肥胖大鼠血脂及血清脂联素的影响〔J〕.山西中医学院学报，2014；15(4)：15-7.

10 高品操，徐广艳，常永娜，等.有氧运动联合KGM对高脂膳食大鼠胰岛素抵抗形成中肝脏Adiponectin/PPARɑ通路的影响〔J〕.中国老年学杂志，2014；34(2)：417-9.

〔2016-03-15修回〕

(编辑 袁左鸣)

Effects of electroacupuncture on adiponectin mRNA expression in adipose tissue of New Zealand rabbits with experimental hyperlipidemia

LAN Cai-Lian,SA Zhe-Yan,DONG Ya-Qin,et al.

Fujian Academy of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350003,Fujian,China

Objective To investigate the effect of electroacupuncture (EA) on Zusanli and Fenglong acupoint on lipid metabolism and adiponectin mRNA expression in adipose tissue of New Zealand rabbits with experimental hyperlipidemia.Methods 24 clean grade New Zealand rabbits were randomly divided into high lipid group and control group,12 rabbits in each group.All experimental hyperlipoidemia rabbits were fed by high fat diet for 8 weeks.Then either high lipid group or control group were randomly divided into blank control group and blank EA group,high lipid control group and high lipid EA group,6 rabbits in each group.Rabbits of blank EA group and high lipid EA group were electro-acupunctured for 10 days,while other groups fixed at the same time once per day.Blood was respectively collected from central auricular artery of rabbits before and after modeling,so as before and after treated by EA.All serum was separated.Four items of blood lipid were tested by 7 180 type Hitachi automatic analyzer.Adiponectin mRNA expression in adipose tissue was detected by Real-time PCR.Results ①The serum levels of TG,TC,LDL-C in rabbits fed by high fat diet were higher than those fed with normal diets(P<0.05).The serum levels of HDL-C were decreased in rabbits fed by high fat diet were higher than those fed with normal diets(P<0.05).The models were made successfully.②With treated by EA for 10 days,the serum levels of TC in rabbits of high lipid EA group decreased significantly(P<0.05),compared with high lipid control group.③The adiponectin mRNA expression is in adipose tissue of high lipid EA group increased significantly(P<0.05),compared with high lipid control group.Conclusions With EA at Stomach-meridian acupoints,the serum level of TC in hyperlipidemia rabbit is decreased and the adiponectin mRNA expression increased significantly,which can improve symptoms of hyperlipidemia to a certain degree.

Hyperlipidemia;Stomach meridian;Electroacupuncture;Adiponectin

国家自然科学青年基金项目(81403490)；福建省科技厅省属公益类科研院所科研专项项目(2014R1035-8)；福建省经络感传重点研究室(2015)

许金森(1963-)，男，硕士生导师，研究员，主要从事中医经络现代研究。

兰彩莲(1984-)，女，硕士，助理研究员，主要从事中医经络现代研究。

R243

A

1005-9202(2016)20-4958-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2016.20.008